Expression, Reinigung, strukturelle und biochemische Charakterisierung der Hämagglutinin-spaltenden Proproteinkonvertase PC5

• Antragstellerin: Dr. Kornelia Hardes
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie ; Biologische und Biomimetische Chemie ; Virologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 309089047

Die Familie der Proproteinkonvertasen (PCs) hat neun Mitglieder, deren katalytische Domäne hoch konserviert ist. PCs spielen bei der Aktivierung zahlreicher Vorläuferproteine von Hormonen oder Enzymen eine zentrale Rolle, spalten aber auch virale Proteine oder bakterielle Toxine. Die kurzzeitige Behandlung einer akuten Infektion mit PC-Hemmstoffen könnte daher eine vielversprechende therapeutische Option sein. Die meisten bekannten PC-Hemmstoffe besitzen jedoch eine geringe Selektivität und hemmen mehrere PCs mit vergleichbarer Stärke, wie im Fall von Furin und PC5. Die Entwicklung selektiver PC-Hemmstoffe ist für die weitere Charakterisierung der Funktion der PCs bei unterschiedlichen Erkrankungen als auch für therapeutische Zwecke von Bedeutung. Abgesehen von Furin sind die anderen PCs hinsichtlich ihrer Spezifität und biologischer Funktion nicht ausreichend charakterisiert. Besonders für PC5 sind nur wenige Daten verfügbar, daher soll PC5 hinsichtlich ihrer Spezifität, Struktur und Eigenschaften weiter charakterisiert werden.Zur Bestimmung eines Selektivitätsprofils der PC5 werden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen sollen bereits verfügbare Inhibitoren und Substrate in enzymkinetischen Messungen auf Unterschiede in der Spezifität untersucht werden. Zum anderen sollen Kristallstrukturen der PC5 gelöst werden, um eine strukturbasierte Entwicklung selektiverer Inhibitoren zu ermöglichen. Hierfür soll PC5 in humanen embryonalen Nierenzellen exprimiert und mittels chromatographischer Methoden gereinigt werden. Der enzymkinetische Assay zur Bestimmung der Inhibitionskonstanten von verfügbaren PC-Hemmstoffen soll etabliert und optimiert werden. Für die Strukturbestimmung mittels kristallographischer Methoden soll das Enzym in ausreichender Menge und Reinheit produziert werden.Furin und PC5 aktivieren das Hämagglutinin (HA) hochpathogener aviärer Influenzaviren der Subtypen H5 und H7 an einer multibasischen Spaltstelle. In Ko-Expressionsexperimenten soll untersucht werden, ob PC5 neben multibasischen Sequenzen auch HAs mit di- oder tribasischen Motiven spalten kann. Diese Ergebnisse sollen mit der Analyse der Spaltung kurzer vom HA abgeleiteter Substrate verglichen werden. Des Weiteren soll die Rolle der PC5 bei der Aktivierung des HAs unter endogenen Bedingungen untersucht werden. Zur selektiven Hemmung sollen small-interfering RNAs und Peptid-konjugierte Phosphoramidat-Morpholino-Oligomere verwendet werden. In weiteren Versuchen soll der Effekt verfügbarer PC-Hemmstoffe auf die PC5-vermittelte Aktivierung des HAs geprüft werden.Die Kombination dieser Ergebnisse ermöglicht die Synthese selektiverer Inhibitoren, die als Hemmstoffe der PC5-vermittelten Aktivierung des Influenza-HAs genutzt werden können. Im Anschluss an dieses Projekt müssten die vielversprechendsten Wirkstoffe hinsichtlich ihrer pharmakologischen Eigenschaften, ihrer Toxizität und ihres therapeutischen Effekts in vivo untersucht werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Kooperationspartnerinnen / Kooperationspartner: Professorin Dr. Eva Böttcher-Friebertshäuser; Professor Dr. Torsten Steinmetzer; Privatdozent Dr. Manuel E. Than