Aufklärung des Interaktionsnetzwerks von Diadenosin-Triphosphat

• Antragsteller: Professor Dr. Andreas Marx
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 310480503

Neben den kanonischen Mono-, Di- und Triphosphaten enthalten Zellen verschiedene andere Nukleotide. Unter diesen sind verschiedene Dinucleosid-Polyphosphate (NpnN, n = 2-7) zu finden. Die Dinucleosid-Polyphosphate bestehen aus zwei Nukleosid-Einheiten, die über eine Polyphosphatkette ausgehend von den jeweiligen 5'-Hydroxylgruppen verbunden sind. Diese Moleküle werden in prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gefunden. Obwohl sie seit 50 Jahren bekannt sind, sind die Funktionen der Dinucleosid-Polyphosphate noch unklar. Einer der am meisten untersuchten Vertreter ist das Diadenosin-Triphosphat (Ap3A). Seine Zellkonzentrationen variieren abhängig vom Zelltyp und Umgebungsfaktoren vom nanomolaren bis auf niedrigere mikromolaren Bereich, wobei eine Zunahme der Ap3A-Konzentration bei Stressbedingungen vielfach beschrieben ist. Daher wurde postuliert, dass Ap3A als zelluläres Signal (Alarmone) von Stressoren dient und damit an Anpassungsprozessen von Zellen auf Stressbedingungen beteiligt ist. Jedoch ist seine weitere Rolle nicht geklärt. Die bekannte humane Ap3A-Hydrolase, und einzig validierter Interaktionspartner, ist das fragile histidine triad protein (Fhit) Protein. Der Verlust von Fhit-Expression und das Verändern seiner enzymatischen Aktivität werden häufig in Krebszellen beobachtet. Ohne jedoch weitere Interaktionspartner zu kennen, wird der Fhit-Ap3A-Komplex vorgeschlagen, das aktive Molekül für die Tumorsuppressoraktivität zu sein. Da das Wissen über das Ap3A-Interactome spärlich ist, haben wir uns die Entwicklung und Anwendung neuer Methoden für die Entdeckung von Ap3A-Interaktionspartnern zum Ziel dieses Projekts gesetzt. Wir werden nicht-hydrolysierbare Ap3A (nh Ap3A)-Analoga entwickeln und synthetisieren, die eine lichtempfindliche Funktionalität zur Photoaffinitätsvernetzung und einen Affinitätsmarker tragen. Nach Inkubation mit Zelllysaten und Bestrahlung des photoreaktiven nh Ap3A-Analog wird dieses kovalent an interagierende Proteine gebunden, die dadurch wiederum mit dem Affinitätsmarker markiert werden. Nach deren Anreicherung über Affinitätschromatographie werden sie durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert. Die identifizierten Proteine werden danach intensiv auf ihre Fähigkeit untersucht, mit Ap3A zu interagieren. Darüber hinaus streben wir an, Einblicke in das Interactome von Fhit und des Fhit-Ap3A-Komplexes zu erhalten. Daher werden wir Methoden entwickeln, um ein nh Ap3A-Analog kovalent an die aktive Stelle von Fhit zu binden. Der FHIT-Ap3A-Komplex wird dann zur Bildung von Affinitätsmatrizen für die Identifizierung von selektiven Bindungspartnern durch Affinitätsreinigung verwendet. Parallel werden wir dazu Matrices einsetzen, die ungebundenes Fhit tragen. Dadurch werden Einblicke in die Unterschiede des Fhit- und Fhit-Ap3A-Interactomes erhalten. Bindende Proteine werden wieder mittels MS identifiziert und anschließend ihre Wechselwirkung mit Fhit und Fhit-Ap3A untersucht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen