Molybdäncofaktor Biosynthese und Crosstalk zum FeS Metabolismus in Neurospora crassa nach ektopischer Expression der Proteine des ersten Moco Biosyntheseschrittes

• Antragsteller: Professor Dr. Ralf R. Mendel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 311118205

Der Molybdäncofaktor (Moco) ist die katalytisch aktive prosthetische Gruppe in Molybdän-haltigen Enzymen. In allen bisher untersuchten Eukaryonten ist der erste Schritt der Moco Biosynthese in Mitochondrien lokalisiert, während alle nachfolgenden Schritte im Cytosol ablaufen. Dieser erste Schritt wird von zwei Proteinen katalysiert, von denen das erste (Nit-7A) zwei FeS Cluster vom [4Fe-4S] trägt. Aber GTP als Ausgangsverbindung ist auch im Cytosol verfügbar, und das Cytosol beherbergt auch eine FeS Cluster Synthesemaschinerie. So erhebt sich die Frage, warum der erste Schritt der Moco Biosynthese in Mitochondrien lokalisiert ist. Unter Nutzung des filamentösen Pilzes Neurospora crassa als hefeähnliches Modellsystem wollen wir den Crosstalk zwischen Moco Biosynthese und FeS Metabolismus untersuchen. In Hefe (S. cerevisiae) wurden alle Grundlagen der eukaryontischen FeS Cluster Biogenese erfolgreich herausgearbeitet, aber Hefe hat keinen Mo Metabolismus. Deshalb planen wir in einer ersten Projektlinie, das N. crassa nit-7 Gen in Hefe zu exprimieren und so den ersten Schritt der Moco Biosynthese in Hefe zu etablieren. Die erfolgreiche Expression von nit-7 in Hefe würde eine völlig neue Perspektive eröffnen, weil uns damit das komplette Arsenal der Hefe FeS Biogenese Forschungswerkzeuge zur Verfügung stünde. Damit würde dieser Ansatz auch Aufklärung bringen, ob der Hefe mitochondriale Exporter Atm1p, der am Export von FeS Cluster Äquivalenten beteiligt ist, auch das Produkt von Moco-Biosynthese Schritt 1 exportieren kann, was wir für sein pflanzliches Homologes ATM3 postuliert hatten. In einer zweiten Projektlinie haben wir bereits in vorbereitenden Experimenten Nit-7A ektopisch und stabil im Cytosol von N. crassa mit nit-7 knock-out Hintergrund exprimiert. Wir planen die Charakterisierung dieses Stammes: (i) phänotpisch (Wachstum auf Nitrat-Medium erzeugt einen starken Bedarf an Moco und FeS), (ii) biochemisch (Re-Isolierung von ektopisch exprimiertem Nit-7A und Nit-7AB und Analyse der FeS Cluster), und (iii) über Transkriptom-Analyse (Nitrat-induzierte Transkriptionsänderungen für FeS Cluster Biogenese und Moco Biosynthese). Damit wollen wir folgende Fragen adressieren: Welches ist der FeS Donor für das ektopisch exprimierte Nit-7A im Cytoslo? Ist dieser Prozeß co-reguliert mit Moco- und FeS-Biosynthese? Gibt es Unterschiede zwischen dem pilzlichen und dem humanen ersten Schritt der Moco Bioisynthese? Zur Erreichung der Ziele dieses Projektantrags wurde eine enge Kooperation mit vier Gruppen des Schwerpunktprogramms vereinbart.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life