Unterschiedliche Protein- und RNA-Interaktionen von Roquin bedingen alternative Mechanismen posttranskriptioneller Genregulation

• Antragsteller: Professor Dr. Vigo Heissmeyer; Professor Dr. Dierk Niessing
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 313381103

Eine angemessene Immunantwort erfordert, dass CD4+ T-Zellen korrekte Entscheidungen bei der Zelldifferenzierung treffen. Ein RNA-Bindeprotein von zentraler Bedeutung für diesen Vorgang ist Roquin, dessen Bindung an kanonische Degradationssignale in seinen Ziel-mRNAs und die darauffolgende Deadenylierung und Entfernung der 5’ gelegenen Cap-Strukur bereits gut erforscht ist. Es gibt jedoch inzwischen zunehmend Hinweise auf komplexere Regulationsmechanismen durch Roquin, bei denen weitere Kofaktoren und Effektoren sowie unterschiedliche cis-agierende RNA-Elemente alleine oder in Kombination unterschiedliche Mechanismen der posttranskriptionalen Genregulation in Gang setzen. Während der ersten Förderphase untersuchten wir die Regulation der Icos mRNA durch Roquin-1. Wir zeigten, dass der Kofaktor Nufip2 direkt mit Roquin interagiert und dessen Bindung an Icos mRNA verstärkt. Weitere Studien von uns und anderen Laboren identifizierten die Endonuklease Regnase-1 und den Deadenylierungsfaktor Cnot1 als weitere Kofaktoren. In der zweiten Förderperiode möchten wir deshalb die Interaktion von Roquin mit Nufip2, Regnase-1 und Cnot1 untersuchen, quantifizieren und ihre Bindungsstellen kartieren. Wir werden Strukturanalysen ihrer Ko–komplexe mittels Röntgenkristallographie, Mikro-Elektronenbeugung (microED) und NMR durchführen sowie strukturbasierte Mutationen einfügen, welche spezifisch binäre Interaktionen stören. Der globale Einfluss solcher Mutationen auf die Genregulation soll schließlich in T-Zellen untersucht werden.Während der ersten Förderphase führten wir einen saturierenden Mutagenese-Screen mit über 10.000 individuellen Mutationen in dem 2,6 kb langen 3‘-UTR der Icos mRNA durch. Mittels Hochdurchsatzsequenzierung quantifizieren wir die Effekte von Mutationen auf Icos mRNA-Regulation. Aus diesem Screen hervorgegangene Cis-agierende Elemente werden jetzt mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie in T-Zellen verifiziert und auf ihre Wirkungsweise hin untersucht. Des Weiteren verwenden wir RNA-gekoppelte „Proximity-Ligation“ Markierungen, um Proteine zu identifizieren, die in der Nähe dieser RNA-Elemente binden. Auf diese Art gefundene RNA-Bindeproteine und Kofaktoren werden sowohl auf ihre Bindung an das jeweilige RNA-Element als auch an Roquin, Regnase-1 und Nufip2 hin untersucht. Die Faktoren mit höchster Relevanz werden anschließend in T-Zellen mittels Knockout und anschließender Analyse der betroffenen Ziel-mRNAs charakterisiert. Zusammenfassend möchten wir Prinzipien kombinatorischer posttranskriptionaler Genregulation verstehen, indem wir untersuchen, wie Roquin-1 mit verschiedenen Faktoren interagiert, um unterschiedliche Mechanismen der Translationskontrolle für seine Ziel-mRNAs auszuführen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1935: Deciphering the mRNP code: RNA-bound determinants of post-transcriptional gene regulation