Räumlich-zeitliche Analyse des Zusammenbaus und der Bewegung von Dynein-Transportkomplexen auf dynamischen Mikrotubuli

• Antragstellerin: Dr. Janina Baumbach
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 313854929

Zytoplasmatisches Dynein ist ein Motorkomplex, der verschiedene Ladungen wie Zellorganellen, mRNA und Viren in Zellen aktiv transportiert. Dies ist besonders wichtig in langen Nervenzellen, und Defekte im Dynein-abhängigen Transport führen zu neurologischen Krankheiten in Menschen. Die Gleise an denen Dynein entlangläuft, Mikrotubuli, sind höchst dynamische Strukturen, die abwechselnd wachsen und schrumpfen. Es ist bekannt, dass eine Gruppe von Proteinen, die an das wachsende Mikrotubuli Plus-Ende binden (Plus-Ende Proteine), wichtig sind um Dynein und seine Fracht auf Mikrotubuli zu laden. Dadurch könnten dynamische Mikrotubuli den zellulären Raum absuchen, und ähnlich eines Such- und Fangmechanismus dazu beitragen, dass zu transportierende Ladungen effizient gefunden und transportiert werden. Es ist jedoch schwierig die Rekrutierung von Dynein auf Mikrotubuli Plus-Enden in der Zelle zu untersuchen, da es nur begrenzt möglich ist einzelne Moleküle in vivo zu visualisieren, und die beteiligten Proteine ein komplexes Netzwerk an Interaktionen ausbilden. Deshalb ist unser Wissen über den Zusammenbau von Dynein-Transportkomplexen und der Initiierung und Durchführung des Transports entlang von dynamischen Mikrotubuli noch sehr begrenzt. Das Ziel dieses Projekts ist es, die Transportinitiierung und Bewegung von Dynein auf dynamischen Mikrotubuli mit aufgereinigten Proteinen in vitro zu rekonstruieren, und dadurch zu analysieren wie dieser Prozess auf molekularer Ebene gesteuert wird. Ich werde rekombinante Proteine, die für die Rekonstitution von beweglichen humanen Dynein-Komplexen benötigt sind, und verschiedene Plus-Ende Proteine, die für die Transportinitiierung in vivo wichtig sind, aufreinigen und mit fluoreszenten Markern versehen. Mit diesen Proteinen werde ich Dynein-Transport auf dynamisch wachsenden Mikrotubuli generieren. Dies wird mit Hilfe einer Fluoreszensmikroskopie-Methode visualisiert, welche die Beobachtung einzelner Moleküle erlaubt. Ich werde als Nächstes verschiedene Plus-Ende Proteine hinzufügen, um das minimale, für die Transportinitiierung von Dynein auf Mikrotubuli Plus-Enden benötigte Set an Proteinen festzustellen. Dann werde ich feststellen in welcher Reihenfolge diese Proteine an das Mikrotubuli Plus-Ende binden müssen indem ich sie mit verschiedenfarbigen Fluoreszenzmarkern versehe und die Transportinitiierung filme. Schlussendlich werde ich die Proteinkomplexe aus Dynein und Plus-Ende bindenden Proteinen, die für die Transportinitiierung wichtig sind, mittels Gelfiltrationschromatographie aufreinigen. Ich werde dann in Kollaboration die Struktur dieser Proteinkomplexe mit Hilfe von Negativkontrastierung, Cryo-Fixierung und Transmissionselektronenmikroskopie aufklären. Das beschriebene Projekt wird uns helfen zu verstehen, wie die Initiierung von Dynein-abhängigem Transport räumlich und zeitlich gesteuert wird, und wie Defekte im Transport zu neurologischen Krankheiten führen können.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Dr. Simon Bullock, Ph.D.