Struktur-Funktionsstudien zur Stöchiometrie und zum gating von DEG/ENaC-Kanälen

• Antragstellerin: Dr. Sylvia Fechner
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 313913559

Sensorische Reize werden von Rezeptoren detektiert, bearbeitet und ins Nervensystem übertragen. Ein Prozess, bei dem Ionenkanäle eine zentrale Rolle spielen. Eine spezielle Gruppe von Ionenkanälen bildet die mechano-elektrischen Transduktionskanäle (MeT). Sie kommen in touch receptor neurons (TRNs) vor und sind darauf spezialisiert, mechanische Reize zu verarbeiten. Im Rundwurm Caenorhabditis elegans ist das durch diese Kanäle generierte elektrische Signal als Antwort auf eine mechanische Stimulation gut charakterisiert. Unbekannt ist jedoch wie der mechanische Reiz in den TRNs detektiert wird und wie das Signal an die MeT-Kanäle weitergeleitet wird, sodass diese sich öffnen: Ein Prozess, der gating genannt wird. Welche Kanalregionen dafür verantwortlich sind ist noch unbekannt. Ein Grund dafür ist, dass die genaue in vivo-Zusammensetzung von MeT-Kanälen bisher nicht geklärt wurde. Bekannt ist, dass sich MeT-Kanäle aus drei Untereinheiten zusammensetzen: Sie bilden Trimere. Die Kanaluntereinheiten stammen aus der Superfamilie der DEG/EnaC/ASIC-Proteine. Zwei der Untereinheiten, die in nativen MeT-Kanälen vorkommen, sind gut beschrieben; eine dritte Untereinheit wurde erst kürzlich entdeckt. Der Beitrag dieser dritten Untereinheit ist bisher nicht geklärt.In dieser Arbeit werde ich das gating von MeT-Kanälen untersuchen. Die experimentelle Strategie ist folgendermaßen: 1. Ich werde alle porenbildenden Untereinheiten identifizieren: a) Ich werde untersuchen, welchen Einfluss der Verlust oder die genetische Veränderung der neuen Kanaluntereinheit mit Hilfe von CRISPR/Cas9 auf die Wahrnehmung mechanischer Reize hat. Die TRNs von entsprechend veränderten C. elegans werde ich mit der FALCON-Technik charakterisieren. FALCON kombiniert in vivo-Elektrophysiologie mit Feedback-kontrollierter mechanischer Stimulation. b) Die Zusammensetzung der MeT-Kanäle werde ich mit Hilfe von bildgebenden Techniken untersuchen. Dazu werde ich zum einen Kanaluntereinheiten verwenden, die an funktionelle fluoreszierende Moleküle gekoppelt werden und zum anderen solche, die jeweils nur eine Hälfte eines fluroeszierenden Moleküls tragen; steigt die Fluoreszenz an, heißt das, dass sich sowohl die getrennten Fluoreszenzmoleküle als auch die Proteine in unmittelbarer Nähe befinden. 2. Ich werde den Beitrag unterschiedlicher Kanalregionen zur mechanischen Aktivierung in vivo untersuchen: mit der FALCON-Technik werde ich MeT Ströme von TRNs analysieren, bei denen Aminosäuren in der zweiten Transmembrandomäne verändert wurden, einem Bereich, der für die Funktion der Kanäle äußerst wichtig ist.Diese Arbeit wird nicht nur dabei helfen die mechanische Wahrnehmung von C. elegans besser zu verstehen, sondern die Ergebnisse lassen sich sowohl auf andere Mitglieder der DEG/ENaC/ASIC Kanalfamilie übertragen als auch auf das generelle Verständnis von mechanosensitiven Ionenkanälen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeberin: Professorin Miriam Beth Goodman, Ph.D.