Der Mechanismus der Aufhebung der Promoter-proximalen Pause von RNA-Polymerase II durch Enhancer RNAs

• Antragsteller: Professor Claus-Dieter Kuhn, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314375425

Enhancer sind regulatorische DNA-Sequenzen, die überall im Genom höherer Organismen vorkommen, und an die Transkriptionsfaktoren binden. Ihre Fähigkeit, Zielgene zu aktivieren, hängt in erster Linie von ihrer räumlichen Nähe zu diesen ab. Somit ist die 3D-Anordnung des Genoms ein Maß für dessen transkriptionelle Aktivität. Neben diesem räumlichen Modell der Enhancer-Aktivität stellte sich in den letzten zehn Jahren heraus, dass Enhancer selbst auch von RNA-Polymerase II (Pol II) abgelesen werden, wobei nicht-kodierende, so genannte Enhancer-RNAs (eRNAs) entstehen. Diese sind für die Induktion von Genen nach Stimuli, z.B. in Neuronen und Makrophagen, wichtig. Trotz dieser Bedeutung ist jedoch der Mechanismus, wie eRNAs die Transkription stimulieren, nicht geklärt. In Neuronen wurde z.B. vorgeschlagen, dass eRNAs die Transkription aktivieren, indem sie das Pausieren von Pol II durch Entfernung von NELF (Negativer Elongationsfaktor) aufheben. In der vergangenen Förderperiode untersuchten wir daher, ob eRNAs NELF von pausierender Pol II verdrängen und ob dies zur Aktivierung der Transkription führt. Beide Fragen konnten bejahen werden - mit der wichtigen Ausnahme, dass eRNAs die Ablösung von NELF von Pol II zwar auslösen, jedoch NELF nicht direkt verdrängen. Unser bisheriger Erfolg wurde durch eine breite Palette biochemischer Techniken ermöglicht, die von der RNA-Strukturkartierung bis hin zu ausgefeilten in-vitro-Assays in Kombination mit Protein-RNA-Quervernetzung und Massenspektrometrie reichten. Diese methodischen Fortschritte erlaubten uns, erste Einblicke in den Mechanismus, wie eRNAs die Transkription in Säugern beeinflussen, zu gewinnen. Auf diesen Ergebnissen aufbauend hat der Folgeantrag drei Ziele. Erstens wollen wir den Mechanismus entschlüsseln, wie multivalente Wechselwirkungen zwischen eRNAs und NELF dessen Dissoziation von Pol II bewirken und ob G-Quadruplex-Strukturen dabei eine Rolle spielen. Zweitens erlauben uns die gewonnenen Erkenntnisse nun, zu untersuchen, wie die Kinase P-TEFb das Aufheben der Pause von Pol II durch Phosphorylierung der Proteinkomplexe DSIF und NELF kontrolliert. Wir planen dabei, nicht nur die Rolle der DSIF- und NELF-Phosphorylierung während des Aufhabens der Pause zu entschlüsseln, sondern auch etwaige Überlappungen zwischen dem eRNA- und P-TEFb-gesteuerten Weg zu ermitteln. Schließlich wollen wir unsere in vitro gewonnenen Erkenntnisse über das Aufheben der Pol II-Pause in einem Estradiol-stimulierten Zellkulturmodell bestätigen und erweitern. Zusammenfassend baut dieser Antrag auf der erfolgreichen Etablierung eines biochemischen Systems zur Untersuchung der eRNA-gesteuerten Pol-II-Pausenfreisetzung in der vorangegangenen Förderperiode auf. Er nutzt diese Basis, um den genauen molekularen Mechanismus der eRNA-induzierten Pol II-Pausenfreisetzung zu entschlüsseln, und er wird Überschneidungen mit dem etablierten, von P-TEFb kontrollierten Weg, der Pol II-Pausenfreisetzung aufdecken.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen