Räumlich-zeitliche Kontrolle bei c-di-GMP-vermittelter Regulation in Shewanella durch die Phosphodiesterase PdeB

• Antragsteller: Professor Dr. Kai Thormann
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314602545

Bakterien besitzen einen hohen Grad an intrazellulärer Organisation, welcher entsprechender räumlich-zeitlicher Regulationsmechanismen bedarf. Dabei ist c-di-GMP ein wichtiges intrazelluläres "second messenger"-Molekül, welches in der Regulation einer Vielzahl zellulärer Prozesse in einer Reihe bakterieller Spezies beteiligt ist. Allerdings besitzen diese normalerweise mehrere potentiell c-di-GMP-produzierende, abbauende, sowie (häufig noch unidentifizierte) c-d-GMP-bindende Proteine. Es ist daher unklar, wie in diesen Zellen die notwendige räumlich-zeitliche Regulation sichergestellt wird. In vorherigen Studien haben wir Mechanismen identifiziert, mit denen in Gammaproteobakterien des Genus Shewanella die polare Rekrutierung des Flagellen- und Chemotaxisapparates organisiert wird. Kürzlich haben wir die c-di-GMP-degradierende Phosphodiesterase PdeB identifiziert, welche für die normale Flagellenfunktion essentiell ist. Interessanterweise lokalisiert PdeB in Abhängigkeit des polaren Markerproteins HubP am flagellierten Zellpol. Unsere bisherigen Daten legen nahe, dass PdeB die Motorfunktion der Flagelle auf eine bisher unbekannte Weise steuert, vermutlich über die Aufnahme eines Signals über eine periplasmatische Domäne bisher unbekannter Struktur. In diesem vorgestellten Projekt werden sowohl Signaleingang als auch der Mechanismus der Wirkung von PdeB auf den Flagellenmotor untersucht. Zudem soll charakterisiert werden, wie die polare Lokalisierung einer Phosphodiesterase zelluläre Prozesse beeinflusst. Dazu werden Domänen von PdeB heterolog produziert und gereinigt, um deren Aktivität bestimmen zu können; die bislang uncharakterisierte periplasmatische Domäne soll zur Aufklärung von Struktur und Rolle bei der Signalerkennung kristallisiert werden. Protein-Interaktionsstudien werden potentielle Faktoren identifizieren, die zur polaren Rekrutierung, Signalerkennung, und beim phenotypischen Output beteiligt sind. Zur Aufklärung des Mechanismus des c-di-GMP-Effekts auf die Flagellenfunktion werden direkte Bindestudien mit Komponenten des Flagellenmotors und Chemotaxisapparates durchgeführt. Parallel dazu soll eine globale Mutationsanalyse sowie ein "c-di-GMP-capture" Ansatz durchgeführt werden, um möglichst umfänglich Faktoren des c-di-GMP-Regulierungsnetzwerks und der entsprechenden zellulären Prozesse zu identifizieren. Fluoreszenzmikroskopische Ansätze werden die Lokalisierungsmuster von PdeB genau auflären. Komplementär dazu werden wir ein genetisches System erstellen, welches eine spezifische Lokalisierung c-di-GMP-degradierender und -synthetisierender Aktivität in bestimmten Zellkompartimenten erlaubt. Dieses System wird anschließen angewandt, um den Effekt lokalisierter gegenüber globaler Aktivität auf die c-di-GMP level und entsprechender zellulärer Prozesse zu charakterisieren.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1879: Nucleotide Second Messenger Signaling in Bacteria