Die Rolle der c-di-GMP spezifischen Phosphodiesterase NbdA in der NO-induzierten Auflösung von Pseudomonas aeruginosa Biofilmen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314811096

Während der Auflösung eines Biofilms werden einzelne Bakterien wieder beweglich und verlassen den Biofilm, um neue Gemeinschaften an neuen Orten zu bilden. Dieser Prozess wird unter anderem durch Änderungen der zellulären Konzentration des sekundären Botenstoffes c-di-GMP gesteuert. Das Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO) induziert die Auflösung von Biofilmen durch die Aktivierung von c-di-GMP abbauender Phosphodiesterase-Aktivität. In Pseudomonas aeruginosa ist die kürzlich von uns beschriebene Membran-gebundene Phosphodiesterase (PDE) NbdA (NO-induced biofilm locus A) spezifisch an diesem Prozess beteiligt. NbdA ist ein Multidomänenprotein bestehend aus einer MHYT-GGDEF-EAL Fusion. Neben NbdA gibt es eine Reihe anderer Proteine, die ebenfalls eine Rolle bei der Auflösung von Biofilmen spielen. So z.B. das Chemotaxis Protein BdlA und die PDE DipA. Um den Mechanismus der NO-induzierten Biofilm Auflösung zu verstehen, soll die Sensorfunktion von NbdA mittels rekombinanten Proteins untersucht werden. Aufgrund bioinformatischer Analysen handelt es sich bei der MHYT Domäne um eine Gassensordomäne mit gebundenen Kupferionen. UV-Vis und ICP-OES Spektroskopie in Verbindung mit ortsgerichteter Mutagenese sollen den Kofaktor und die koordinierenden Aminosäuren identifizieren. Zusätzlich soll untersucht werden, ob NO einen stimulierenden Effekt auf die PDE Aktivität von NbdA hat. Da eine nbdA knock-out Mutante nicht mehr in der Lage ist, durch NO-Zugabe Biofilme aufzulösen, soll mit Hilfe von Kreuzkomplementationsexperimenten mit bekannten disperion loci die Reihenfolge der Signaltransduktion aufgeklärt werden. Zusätzlich soll ein in vivo Membrane-SPINE Experiment direkte Interaktionspartner von NbdA identifizieren. Hinweise auf eine NO-abhängige transkriptionelle Regulation von nbdA soll mit Hilfe von LOV-basierten Fluoreszenzreporterfusionen untersucht werden. Verschiedene NO-spezifische Transkriptionsregulatoren sollen hierbei ebenfalls getestet werden. In diesem Zusammenhang wird zu klären sein, inwieweit endogenes gegenüber exogenem NO einen Einfluss auf die Biofilm Auflösung hat. Dafür werden wir uns einer P. aeruginosa Mutante bedienen, die in der Lage ist, eine katalytisch inaktive, aber strukturell intakte Nitritreduktase zu synthetisieren. Als Hilfsmittel für die SPP Gemeinschaft ist die Entwicklung einer lichtkontrollierbaren PDE ausgehend vom bakteriellen Phytochrom aus P. aeruginosa geplant. Ziel ist es, unabhängig von chemischen, potentiell schädlichen Molekülen die Auflösung von Biofilmen lediglich durch Bestrahlung mit dunkelrotem Licht untersuchen zu können. Als langfristiges Ziel möchten wir die Signaltransduktion von der Signalaufnahme bis hin zur zellulären Antwort verstehen. Hierfür sollen fluoreszierende Reportergenfusionen sowie Nukleotid capture compounds zur Hilfe genommen werden.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1879: Nucleotide Second Messenger Signaling in Bacteria