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Projekt
Entwicklung und Anwendung neuer optogenetischer Werkzeuge in spezifischen intrazellulären Kompartimenten
Antragsteller
Professor Dr. Peter Hegemann; Dr. Benjamin Rost
Fachliche Zuordnung
Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
Biophysik
Biophysik
Förderung
Förderung von 2016 bis 2022
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315457904
Ziel unserer Arbeiten im Rahmen des Projektantrages ist es, neue optogenetische Anwendungen zur Erforschung subzellulärer Kompartimente zu entwickeln.Im ersten Teilprojekt werden wir licht-gesteuerte Protonen- und Chloridkanäle bzw. Chloridpumpen mit Targetingsequenzen kombinieren, um eine organell-spezifische Expression in synaptischen Vesikeln (SV) oder Lysosomen zu erreichen. Dazu werden wir den kürzlich von uns publizierten Ansatz zur optogenetischen Ansäuerung dieser Organellen mittels der lichtaktivierten Protonenpumpe Arch3 nutzen. Um eine akute Depletion von Protonen aus SV bzw. Lysosomen zu erreichen werden wir einen von der AG Hegeman durch Mutagenese erzeugten Arch3-basierten Protonenkanal verwenden. Für die Manipulation der luminalen Chloridkonzentration werden wir chloridleitende Kanalrhodopsine oder licht-aktivierte Chloridpumpen implementieren. Als Targetingsequenzen werden wir das Tetraspanin Synaptophysin für SV bzw. CD63 für Lysosomen verwenden. Die lichtgesteuerten Aktuatoren werden mit genetisch kodierten, optischen Indikatoren für den luminalen pH oder die Membranspannung kombiniert, welche zuvor biophysikalisch charakterisiert und verbessert werden. Alle Konstrukte werden mittels Lentiviren oder Adeno-assoziierten Viren in primären Neuronenkulturen exprimiert und elektrophysiologisch sowie durch funktionelle Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Die von uns entwickelten Proteine werden detaillierte Untersuchungen der Ionenhomöostase in endolysosomalen Kompartimenten in lebenden Zellen ermöglichen.Im zweiten Teilprojekt werden wir präsynaptisch-exprimierte lichtaktivierbare Adenylylzyklasen entwerfen, mittels derer optogenetische Untersuchungen von präsynaptischer Langzeitpotenzierung (LTP) möglich werden. Die bakterielle photoaktivierbare Adenylylzyklase bPAC wird mit verschiedenen präsynaptischen Proteinen fusioniert, und ihre Funktion in heterologen Expressionssystemen sowie ihr Lokalisation in Neuronen getestet. Im nächsten Schritt wird der Effekt von präsynaptischer bPAC-Aktivierung auf synaptische Transmission in autaptischen Kulturen von hippokampalen Körnerzellen untersucht, welche wir als in-vitro Model für präsynaptisches LTP etabliert haben. Daran anschließend werden wir die Anwendung der präsynaptischen bPAC auf hippokampale Schnittkulture übertragen und den Einfluss von bPAC-Aktivierung auf die Transmission von Moosfasersynapsen untersuchen. Mittels stereotaktischer Injektion von Adeno-assoziierten Viren in den Gyrus Dentatus werden wir danach die präsynaptische bPAC in vivo exprimieren und ihre Funktion in akuten hippokampalen Schnittpräparaten demonstrieren. Die Möglichkeit, durch Licht präsynaptisches LTP in genetisch definierten Neuronen auszulösen wird zum einen neue Möglichkeiten zur Untersuchung der molekularen Mechanismen von präsynaptischem LTP eröffnen. Darüber hinaus wird dieser Ansatz neue in-vivo Studien zum Einfluss von präsynaptischem LTP auf Lernen, Gedächtnis und Verhalten ermöglichen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
