Analyse der Kopplung zwischen Substratbindung und ATP-Hydrolyse in kanonischen homo- und heterodimeren Aminosäure-ABC-Importsystemen

• Antragsteller: Professor Dr. Erwin Schneider
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315832426

Klassische prokaryotische ABC-Transporter zur Aufnahme chemischer Verbindungen in das Cytoplasma (Typ I und II) bestehen aus einem membranständigen Komplex zweier porenbildender Untereinheiten mit einem ATPase-Dimer. Zusätzlich ist ein extracytoplasmatisches Substrat-Bindeprotein erforderlich. Das derzeit diskutierte Modell zur Funktionsweise von Typ I-Importern beruht vorwiegend auf strukturellen, biochemischen und biophysikalischen Daten über den Maltose-ABC-Transporter (MalE-FGK2) aus E. coli/Salmonella. Dieses System war bis vor kurzem auch das einzige, bei dem eine Substratbindestelle im Transmembranbereich identifiziert werden konnte. Neueste Kristallstrukturen eines homodimeren Aminosäuretransporters (ArtI-Q2M2) im Komplex mit zwei Substratmolekülen in der Translokationspore werfen Fragen zum generellen Mechanismus von Typ I-Importern auf, die wir in der beantragten letzten Förderperiode bearbeiten wollen: (i) Müssen in einem homodimeren Transporter beide Substratbindestellen belegt sein, um die ATP Hydrolyse zu initiieren? (ii) Enthalten nur homodimere Aminosäuretransporter zwei Substratbindestellen oder trifft dies auch auf heterodimere Systeme zu? (iii) Lässt sich ein heterodimerer Transporter in einen homodimeren Transporter umwandeln? Um diese Fragestellungen zu bearbeiten, wollen wir wie bisher den heterodimeren Histidin-Transporter (HisJ/LAO-HisQMP2) aus S. Typhimurium und den homodimeren Arginin-Transporter (ArtJ-M2P2) aus Geobacillus stearothermophilus als Modellsysteme nutzen. Laufende Untersuchungen zur Dynamik der Wechselwirkung zwischen HisJ und dem Transporter mittels ESR(DEER)-Spektroskopie sollen fortgesetzt und abgeschlossen werden. Mittels Mutagenese soll aus dem Art(MP)2-Transporter ein Hybridsystem erzeugt und enzymatisch charakterisiert werden, welches nur noch eine Substratbindestelle in einer ArtM-Untereinheit enthält. Komplementär dazu wollen wir die funktionellen Konsequenzen der Einführung einer putativen zweiten Bindestelle im Histidin-Transporter (in HisQ) untersuchen. Schließlich sollen durch ungerichtete Mutagenese Suppressormutationen in HisJ/HisQM erhalten werden, die gekoppelten Transport durch einen homodimeren His(MP)2- oder His(QP)2-Komplex ermöglichen. Wir erwarten, dass die Ergebnisse dieser Untersuchungen, deren Durchführbarkeit durch initiale Experimente belegt ist, zum besseren Verständnis des Mechanismus von ABC-Transportern beitragen werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen