Bestimmung der Bindungstopologien von beta-Arrestinen an nicht visuellen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in lebenden Zellen mittels genetischem Einbau von chemischen Tools

• Antragstellerin: Professorin Dr. Irene Coin
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 316443431

Beta-Arrestine sind unmittelbare Signalvermittler der ungefähr 800 G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die durch das humane Genom kodiert sind. Arrestin-GPCR-Komplexe sind sehr dynamisch und stellen damit eine große Herausforderung für die Kristallographie und Cryo-EM dar. Die wenigen Strukturen, die bisher aufgeklärt wurden, betreffen Rezeptoren mit stark phosphoryliertem C-Terminus und häufig erheblichen künstlichen Modifikationen. Das grundlegende Ziel dieses Projektes besteht in der Identifizierung topologischer Merkmale der Beta-Arrestinbindung an vollständig glykolysierte und minimal modifizierte GPCRs direkt unter natürlichen Bedingungen in lebenden Säugerzellen. Wir verwenden dazu genetisch kodiert nicht-canonische Aminosäuren für umfangreiche photochemische und chemische Crosslinking Experimente. Wir kartieren dabei Kontaktpunkte innerhalb von Arrestin-GPCR-Komplexen und bestimmen intermolekulare Paare von Arrestin-Rezeptor-Aminosäuren, die in gegenseitiger Nachbarschaft liegen. Wir verwenden diese Informationen in molekularen Modellierungen und entwickeln so detaillierte Modelle der GPCR-Arrestin-interaktion. Im ersten Finanzierungszeitraum haben wir mittels dieser Strategie die stabile Wechselwirkung zwischen beta-Arrestin-1 und dem Parathyroidhormonrezeptor PTH1R charakterisiert. Basierend auf mehr als 300 experimentell bestimmten constraints haben wir ein detailliertes Modell für den PTH1R-beta-arr-1-Komplex entwickelt. Das Modell offenbart eine Reihe von Details in flexiblen Bereichen wie Loops und der C-terminalen Region des Rezeptors, die in allen publizierten GPCR-Arrestin-Strukturen fehlen, und zeigt die Bedeutung von einigen Regionen von Arrestin, besonders die der fernen Region der N-Domäne (N-edge). Darüber hinaus zeigen wir, dass unsere Strategie auch auf transiente GPCR-Arrestin-wechselwirkungen, die den klassischen Strukturbestimmungsmethoden nicht zugänglich sind, anwendbar ist. Im Folgenden wollen wir herausfinden, ob die beobachtete Bedeutung des N-edge ein allgemeines Merkmal für verschiedene GPCRs ist und möglicherweise auch für beta-Arrestin-2. Wir wollen weiterhin von uns beobachtete alternative Gestaltungen des PTH1R-Arrestin Komplexes charakterisieren, die weder im vorherrschenden Zustand unseres Modells noch in einer der publizierten Strukturen gezeigt werden. Des Weiteren wollen wir die Arrestinbindung an GPCRs, die keinen stark phosphorylierten C-Terminus besitzen, charakterisieren, wofür 3D-Ergebnissen völlig fehlen. Und drittens wollen wir den Einfluss von Phosphorylierungsmuster, die durch verschiedene GPCR-Kinasen erzeugt werden, auf konformationelle Merkmale für die Arrestinbindung untersuchen als auch transiente GPCR-Arrestinkomplexe charakterisieren. Wir erwarten, dass unsere Ergebnisse dazu beitragen, das Wissen über die GPCR-Arrestinwechselwirkung wesentlich zu erweitern, insbesondere das Zusammenspiel zwischen GPCR-Phosphorylierung und strukturellen Merkmalen der Arrestin- gebundenen GPCRs.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen