NanoPlan - Entschlüsselung des molekularen Bauplans integrin-basierter Zell-Adhäsionen.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Fähigkeit von Säugetierzellen, fest an der extrazellulären Matrix anzuhaften und die mechanischen und chemischen Eigenschaften der Umgebung wahrzunehmen, ist für viele entwicklungsbiologische und homöostatische, aber auch pathophysiologische Prozesse in multizellulären Organismen unverzichtbar. Bei Tieren wie beim Menschen wird diese Funktion weitestgehend durch eine Familie von Rezeptoren, den Integrinen, vermittelt, die auf der Oberfläche von Zellen exprimiert werden, wo sie – nach Aktivierung – extrazelluläre Liganden binden. Gleichzeitig verbinden sich Integrine mit dem intrazellulären Zytoskelett und stellen so eine mechanische Verbindung zwischen den Zellen und ihrer extrazellulären Umgebung her. Interessanterweise werden Integrine durch intrazelluläre Proteine streng reguliert, die sich an der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors zu einer multimolekularen Struktur, der fokalen Adhäsion, zusammenschließen. Sowohl die Aktivierung der Integrin-Rezeptoren als auch ihre Verbindung mit dem Zytoskelett werden durch Adaptorproteine, wie Talin und Kindlin, vermittelt. Es war jedoch vor Beginn dieses Projektes unklar, in welcher Weise die intrazelluläre Adaptorproteine mit Integrinen assoziieren, zum Beispiel um die Rezeptoraktivierung zu vermitteln. In diesem Projekt wollten wir daher die nanoskalige Organisation der Integrin-basierten Adhäsion in Zellen erforschen. Wir verfolgten dabei hochauflösende Mikroskopie-basierten Ansätze, der eine quantitative Analyse von fokalen Adhäsionen in Zellen auf molekularer Ebene möglich machen sollten. Die letztendlich etablierte Methode, die über den ursprünglich angedachten Ansatz deutlich hinausgeht, basiert auf DNA-PAINT und kombiniert Einzelprotein-Bildgebung, automatisierte Cluster-Detektion und Datensimulations-Verfahren mit zellbiologischen Experimenten, um absolute Fraktionen und räumliche Koordinaten interagierender molekularer Spezies auf molekularer Ebene zu bestimmen. Mit Hilfe dieses neuen Verfahrens konnten wir zum ersten Mal zeigen, dass β1-Integrin Rezeptoren gleichzeitig mit Talin und Kindlin assoziiert sein können, um einen ternären Adhäsionskomplex während der Zelladhäsion zu bilden. Da der entwickelte Ansatz ein sorgfältiges genetisches Engineering erfordert, das für viele zukünftige Projekte nicht immer möglich sein wird, haben wir unseren Ansatz anschließend weiterentwickelt, um die nanoskalige Organisation von Adhäsionsproteinen mit einem Peptid-PAINT-Ansatz untersuchen zu können. Diese Arbeiten zeigen, dass Informationen auf molekularer Ebene auch in genetisch unveränderten Zellen und sogar Gewebeproben mit ähnlicher Empfindlichkeit wie bei DNA-PAINT-basierten Strategien quantifiziert werden können. Insgesamt liefern die Ergebnisse des Projektes also nicht nur neue Einblicke in die molekulare Organisation von Zell-Matrix-Adhäsionen, sondern stellt auch eine quantitative Technologie zur Untersuchung subzellulärer Strukturen auf molekularer Ebene bereit.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Unforgettable force – crosstalk and memory of mechanosensitive structures. Biological Chemistry, 400(6), 687-698.
Kanoldt, Verena; Fischer, Lisa & Grashoff, Carsten
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Molecular Force Measurement with Tension Sensors. Annual Review of Biophysics, 50(1), 595-616.
Fischer, Lisa S.; Rangarajan, Srishti; Sadhanasatish, Tanmay & Grashoff, Carsten
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Peptide‐PAINT Enables Investigation of Endogenous Talin with Molecular Scale Resolution in Cells and Tissues. ChemBioChem, 22(19), 2872-2879.
Fischer, Lisa S.; Schlichthaerle, Thomas; Chrostek‐Grashoff, Anna & Grashoff, Carsten
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Quantitative single-protein imaging reveals molecular complex formation of integrin, talin, and kindlin during cell adhesion. Nature Communications, 12(1).
Fischer, Lisa S.; Klingner, Christoph; Schlichthaerle, Thomas; Strauss, Maximilian T.; Böttcher, Ralph; Fässler, Reinhard; Jungmann, Ralf & Grashoff, Carsten
