Aufklärung irreversibler Reaktionen von Lichtrezeptoren und Enzymen durch die Kombination aus einem Infrarot-Quantenkaskadenlaser und einem Flusszellensystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie liefert wertvolle Informationen über die Mechanismen von Proteinen in Lösung. Irreversible Reaktionen in Photorezeptoren und Enzymen sind dabei eine Herausforderung, da die vielfache Wiederholbarkeit für die Mittelung nicht gegeben ist. Um diese Reaktionen zu untersuchen, haben wir einen Aufbau entwickelt, der einen modernen Quantenkaskadenlaser (QCL) als breit durchstimmbare und hochintensive Messlichtquelle enthält. Der Probenverbrauch wurde minimiert, indem der Laser in eine Flusszelle fokussiert wird und ein Mikrometer-Verschiebetisch die Probe senkrecht zum Fluss bewegt. Wir haben Spektren und Kinetik der irreversiblen Photoreduktion des Flavins in H2O in einem Zeitbereich von 20 Nanosekunden bis 1 Sekunde mit einem Probenverbrauch von nur 12 Mikrolitern aufgenommen. Daraus wurde ein Referenzspektrum des Flavin-Anionradikals erhalten, das ein gängiges Intermediat in Enzymreaktionen ist. In einem experimentellen Vergleich des QCL-Aufbaus mit einem Doppel-Frequenzkamm-Spektrometer zeigen wir die Komplementarität der beiden modernen Ansätze. Letzterer erlaubte es uns zum ersten Mal, eine Proteinreaktion durch eine einzige Anregung zu charakterisieren. Ersterer Ansatz erzielt dagegen eine höhere Zeitauflösung und deckt einen breiteren spektralen Bereich ab. Der QCL-Aufbau wurde daraufhin erfolgreich auf die Photorezeptoren Pflanzencryptochrom und Tier-ähnliches Cryptochrom in H2O angewendet, die ein Flavin als Chromophor binden und zentrale Antworten von Grünalgen auf Licht regulieren. So zeigen wir, dass wesentliche Änderungen in der Sekundärstruktur des Pflanzencryptochroms erst nach 100 ns auftreten und daher von dem Elektronentransfer im Femtosekundenbereich entkoppelt sind. Zusammenfassend vereinfacht der entwickelte Aufbau mit einem Quantenkaskadenlaser als Messlicht wesentlich die Aufklärung von irreversiblen Prozessen in Photorezeptoren und Kofaktoren in H2O, indem der Probenverbrauch drastisch reduziert wird.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2018) Single-Shot Sub-microsecond Mid-infrared Spectroscopy on Protein Reactions with Quantum Cascade Laser Frequency Combs, Anal. Chem. 90, 10494-10500
J. L. Klocke, M. Mangold, P. Allmendinger, A. Hugi, M. Geiser, P. Jouy, J. Faist and T. Kottke
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(2020) A Quantum Cascade Laser Setup for Studying Irreversible Photoreactions in H2O with Nanosecond Resolution and Microlitre Consumption, Phys. Chem. Chem. Phys. 22, 26459-26467
J. L. Klocke and T. Kottke
