Charakterisierung von nicht-kanonischen Funktionen humaner ATG8-Proteine

• Antragsteller: Professor Christian Behrends, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 318126409

Die Proteine der ATG8 Familie sind entscheidende Akteure bei der Autophagie, die defekte bzw. überzählige Komponenten aus dem Zytosol an Lysosomen zur Degradation anliefert. Während der Autophagie sind ATG8s an Doppelmembran-Autophagosomen kovalent gebunden, um die Rekrutierung der Ladung, die Biogenese der Autophagosomen und deren Fusion mit Lysosomen zu erleichtern. Darüber hinaus können ATG8 Proteine auch an Einzelmembran-Organellen gebunden sein, was zu höchst unterschiedlichen Abbau- bzw. Sekretionprozessen führt. Dabei üben ATG8s nicht-kanonische Funktionen aus, deren Regulationsmechanismen weitgehend ungeklärt sind. Die Abhängigkeit von Überexpressionssystemen und der Mangel an spezifischen Antikörpern erschweren jedoch die Analyse dieser neuen Funktionen. In der vergangenen Förderperiode haben wir durch Genom-Editierung eine Reihe von Zellen etabliert, in denen einzelne LC3- und GABARAP Gene der ATG8 Familie nahtlos an ihren natürlichen chromosomalen Positionen mit einem Affinitätsepitop versehen wurden. Diese Zellen wurden der Autophagie Gemeinschaft zugänglich gemacht und haben sich als wertvolle Ressource für die Untersuchung von GABARAPs und LC3s erwiesen. Mittels dieser Zellen haben wir endogene GABARAPL2 Proteinkomplexe kartiert. Dieser Ansatz identifizierte den ER-ständigen Lipid Droplet (LD) Biogenesefaktor ACSL3 als Bindungspartner. GABARAPL2 bindet ACSL3 durch dessen LC3-interagierende Regionen, welche erforderlich sind, um GABARAPL2 an das ER zu rekrutieren. Wichtig ist, dass die GABARAPL2-ACSL3 Interaktion zur Verankerung des Proteins UBA5 im ER beiträgt. UBA5 ist Teil der Enyzmkaskade, deren Aktivität zur kovalenten Bindung des Ubiquitin-ähnlichen Proteins UFM1 an Zielproteine führt (Ufmylierung). Im Einklang mit der Vorstellung, dass ACSL3 zur räumlichen Anordnung der Ufmylierungsmaschinerie beiträgt, beeinträchtigt die ACSL3 Depletion bzw. die LD Bildung die Menge von UFM1-Konjugationskomponenten und hemmte die ER-Phagie, die ein bekanntes regulatorisches Ziel dieser Faktoren ist. Damit haben wir die GABARAPL2-ACSL3-Interaktion als neuen Ufmylierungsregulator identifiziert. Für die nächste Förderperiode schlagen wir vor, diese neue nicht-kanonische Rolle von GABARAPL2 weiter zu untersuchen, indem wir dessen Bindung an ACSL3 untersuchen, den ER-Verankerungsmechanismus von UBA5 bestimmen und Zielproteine der Ufmylierungs-reaktion als Reaktion auf Lipidstress identifizieren. Unsere Entdeckung, dass die Induktion der LD Bildung ein robuster Auslöser der Ufmylierung ist, bietet ein neuartiges Mittel zur Überwindung der bisherigen Schwierigkeiten bei der Erforschung des Ufmyloms, die auf das Fehlen definierter, UFM1 Konjugation auslösenden Bedingungen zurückzuführen sind. Die Identifizierung von UFM1 Zielproteine ist wichtig, um den Mechanismus dieses ungewöhnlichen aber essentiellen Ubiquitin-ähnlichen Konjugationssystems zu verstehen und die biologische Bedeutung der Kopplung von Ufmylierung und LD Biogenese zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen