Enzyme der Alkoholbildung im thermophilen Bakterium Thermoanaerobacter sp. Stamm X514

• Antragsteller: Professor Dr. Mirko Basen
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 319182766

Thermoanaerobacter-Arten sind saccharolytische thermophile Bakterien mit einem Temperaturoptimum von 60 °C oder höher. Sie bilden hauptsächlich Ethanol, aber auch Wasserstoff, Acetat und Lactat während der Vergärung von Zuckern. Die Enzyme und Stoffwechselwege der Ethanolbildung wurden in einigen Arten untersucht. Während in einer Art (T. mathranii) die bifunktionelle Aldehyd/Alkohol-Dehydrogenase AdhE essentiell war, wurde für weitere Arten (T. ethanolicus, T. pseudethanolicus) eine Beteiligung weiterer Alkoholdehydrogenasen vorgeschlagen. Die bei der Ethanolbildung in Thermoanaerobacter beteiligten Enzyme sind also nicht abschließend bestimmt; und unterscheiden sich möglicherweise von Art zu Art. Weiterhin ist unklar, wie das bei der Pyruvatoxidation anfallende reduzierte Ferredoxin oxidiert wird. In vorläufigen Experimenten mit Thermoanaerobacter sp. Stamm X514 konnte ich zeigen, dass dieser Organismus zusätzlich eine Aldehyd:Ferredoxin Oxidoreduktase (AOR) produziert. Kürzlich habe ich publiziert, dass ein solches Enzym essentiell für die Ethanolbildung in einer Mutante des hyperthermophilen Archaeon Pyroccus furiosus ist. Die Mutante produzierte zusätzlich zur eigenen AOR auch die Alkoholdehydrogenase AdhA aus Thermoanaerobacter sp. Stamm X514. Der resultierende AOR-AdhA-Stoffwechselweg führte zur einer Reduktion des Gärungsendproduktes Acetat zu Ethanol sowie zugesetzter organischer Säuren zu den korrespondierenden Alkoholen. Weitere vorläufige Experimente zeigten, dass auch Thermoanaerobacter sp. Stamm X514 in Gegenwart von Cellobiose z. B. Isobutyrat zu Isobutanol reduziert. Basierend auf diesen vorläufigen Befunden schlage ich vor, dass Thermoanaerobacter sp. Stamm X514 zumindest partiell den AOR-AdhA-Weg benutzt, um Acetat oder andere organischen Säuren zu den korrespondierenden Alkoholen zu reduzieren. Diese Hypothese soll überprüft werden. Aldehyd-und Alkoholdehydrogenasen sowie Ferredoxin-oxidierende Enzyme (ggf. AOR sowie Ferredoxin:NAD(P)H oxidoreduktasen wie Rnf oder Nfn) sollen gereinigt und charakterisiert werden. Eine Analyse des Transkriptoms wird für die Alkoholbildung wichtige Gene/Enzyme aufdecken. Ein genetisches System wird entwickelt werden, woraufhin die Gene der für die Alkoholbildung oder Ferredoxin-Oxidation wahrscheinlich wichtigen Enzyme wie z. B. die bifunktionelle Aldehyde/Alkohol Dehydrogenase AdhE, die primäre Alkoholdehydrogenase AdhA, die sekundäre Alkoholdehydrogenase AdhB, AOR, Rnf oder Nfn deletiert werden. Die Deletionsmutanten werden in Wachstums- und Zellsuspensionsexperimenten untersucht werden, insbesondere auf ihre Fähigkeit zur Produktion von Alkoholen. Zusammengefasst wird die Kombination von biochemischen, genetischen, physiologischen und Transkriptom- Analysen zu umfangreichen Erkenntnissen über die bei der Alkoholproduktion beteiligten Enzyme in Thermoanaerobacter sp. Stamm X514 führen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: USA
• Kooperationspartner: Intawat Nookaew, Ph.D.