Identifizierung, Charakterisierung und Optimierung chemischer Substanzen für die Herstellung chemisch induzierter menschlicher pluripotenter Stammzellen

• Antragsteller: Dr. Xinlai Cheng
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 321028751

Die klinische Nutzung dieser induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) Methode ist stark eingeschränkt durch eine niedrige Effizient der etablierten Protokolle und der Anhäufung genetischer und epigenetischer Veränderungen im Verlauf der Reprogrammierung und Kultivierung. Da sich chemische Wirkstoffe gut für die Anwendung an Zellen eignen und durch verschiedene Methoden optimiert lassen, eröffnet die chemische Reprogrammierung einen vielversprechender Weg für die transgen-freie Herstellung von iPSCs. Seit der Veröffentlichung eine erste Kombination chemischer Wirkstoffe zur Reprogrammierung 2013, wurden eine Reihe verschiedener Wirkstoffkombination publiziert, mit denen eine chemische Induktion von Maus-iPSCs (mciPSCs) erreicht werden konnte. Die Herstellung humaner-ciPSCs ist jedoch nicht gelungen. Im laufenden DFG Projekt konnte ich mit meiner Gruppe nun zeigen, dass Imidazolpyridine als H3K4-spezifische Demethylase-Inhibitoren (KDM5-Inhibitoren) wirken. In den Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Leitstruktur OCT4-induzierende Verbindung 3 (O4I3) die Demethylierung von H3K4 verhindert und so die Konzentration von H3K4Me3 am Promotor von OCT4 erhöht. Dadurch wird die Effizienz der Reprogrammierung von primären Patienten-Fibroblasten duetlich verbessert. Ein Teil dieser Ergebnisse wurde in iScience (Cell Press) publiziert. Die Verbindung wurde auch von der Universität Heidelberg zum Patent angemeldet und wird in Kooperationen auch von anderen Forschungslaboren genutzt. Darüber hinaus, wurde eine weitere Leitstruktur O4I2, die bereits 2015 publiziert wurde, aufgrund von Ergebnissen zur Metabolisierung weiter verbessert und ein stabileres Derivat O4I4 hergestellt. Die Kombination von O4I3 mit O4I4 konnte erfolgreich genutzt, um menschliche Fibroblasten ohne Expression von exogenem Oct4 nur mit den Faktoren SOX2, KLF4 und MYC zu reprogrammieren. Mit dem vorliegenden Verlängerungsantrag beantrage ich eine Verlängerung des Forschungsprojektes, um noch weitere offene Fragen zu bearbeiten, die im aktuellen Förderzeitraum nicht bearbeitet werden können. Neben der Aufklärung der Wirkmechanismen der Verbindungen ist insbesondere geplant zu untersuchen, ob eine chemische Reprogrammierung durch die Kombination von O4Is mit anderen chemischen Verbindungen möglich ist. Der Schwerpunkt der Arbeiten wird daher auf der Herstellung von hciPSCs liegen. Für die Aufklärung der zellulären Wirkmechanismen bei der Reprogrammierung mit dem erablierten Protokoll CSKM wird neben Proteomanalyse mit (biotinyliertem) O4I4, auch Transkriptomanalyse mit RNA-Seq und Chromatinänderungen mit ATAC-Seq, sowie andere etablierte Methoden zur Targetidentifikation genutzt werden. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass SOX2 bisher noch nicht durch geeignete chemische Verbingungen ersetzt werden kann. Eine wichtige Aufgabe wird daher die Herstellung und weitere Verbesserung von im Screening identifizierter Leitstrukturen, SOX2 induzierenden Verbindungen 1 und 2 (S2I1/2), sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen