Funktion der Typ-III Sekretionssystem-assoziierten ATPase während des Proteinexports des bakteriellen Flagellums

• Antragsteller: Professor Dr. Marc Erhardt
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 322866343

Das bakterielle Flagellum und das evolutionär verwandte Injektisom vieler gramnegativer Krankheitserreger nutzen ein konserviertes Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) für die Sekretion von Substratproteinen. Das T3SS besteht aus einem im Basalkörper eingebetteten Proteinkanal und einem löslichen ATPase-Komplex (FliH, FliI und FliJ im Falle des Flagellums). Das T3SS hat die einzigartige Fähigkeit, verschiedene Substratklassen zu erkennen (Substratwechsel von frühen zu späten Substraten), was für den ordnungsgemäßen Zusammenbau des Flagellums von entscheidender Bedeutung ist. Eine Hypothese ist, dass der ATPase-Komplex eine Rolle beim Targeting von Chaperon-Substrat-Komplexen und bei der Entfaltung von Substratproteinen spielt. Allerdings wurde auch in ATPase-defizienten Mutanten eine Rest-Proteinsekretionsaktivität nachgewiesen. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass der sekundäre Botenstoff zyklisches di-GMP (cdG) an die ATPase FliI bindet, was auf eine mögliche neue Rolle dieses Botenstoffs bei der Flagellumbildung hindeutet. Die physiologische Rolle der Bindung von cdG und der ATP-Hydrolyse durch die ATPase FliI für den Proteinsekretionsprozess über T3SS ist entsprechend noch weitgehend unklar.Basierend auf vorläufigen Ergebnissen stellen wir die Hypothese auf, dass die Bindung von cdG die Oligomerisierung und damit die ATPase-Aktivität von FliI moduliert, was wiederum den Wechsel der Substratspezifität des flagellaren T3SS von frühen zu späten Substraten reguliert. In diesem Projekt haben wir das Ziel, die Rolle der cdG-Bindung und ATP-Hydrolyse des FliI ATPase-Komplexes während des Proteinsekretionsprozesses aufzuklären. Konkret wollen wir untersuchen: (i) wie die cdG-Bindung die ATPase-Aktivität von FliI moduliert und dadurch die Substratspezifität reguliert; (ii) ob FliI zur Entfaltung von Sekretionssubstraten und zur Freisetzung von Chaperon-Substrat-Komplexen beiträgt; und (iii) wie die ATPase-Funktion und cdG-Bindung die subzelluläre Lokalisierung und Oligomerisierung von FliI moduliert.Die verschiedenen Fragen werden in einem vergleichenden Ansatz untersucht, indem die Proteinsekretion, die ATPase-Oligomerisierung und die subzelluläre Lokalisierung von Wildtyp-FliI sowie von Punktmutanten, die einen Defekt in der ATP-Hydrolyse und/oder cdG-Bindung aufweisen, mit einer Kombination aus genetischen und biochemischen Ansätzen sowie Einzelmolekül- und super resolution Mikroskopie analysiert werden.Zusammenfassend erwarten wir, dass diese Experimente die physiologische Bedeutung der ATP-Hydrolyse und der mutmaßlichen cdG-Bindung für die Funktion von FliI aufklären, sowie verschiedene mögliche Mechanismen testen, wie die cdG-Bindung den Proteinexport über T3SS regulieren könnte.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen