Proteinarchitektur und mechanische Eigenschaften der Clathrin-vermittelten endozytotischen Maschinerie

• Antragsteller: Michal Skruzny, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323495273

• Erstellungsjahr: 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Die Clathrin-vermittelte Endozytose, ein Hauptweg des Membrantransports für die Aufnahme von Nährstoffen, Signalen, und Plasmamembrankomponenten, ist ein wichtiger Membranumgestaltungsprozess in allen eukaryotischen Zellen. Während der Endozytose biegt sich ein kleiner Bereich der Plasmamembran in die Zelle hinein, um ein endozytotisches Vesikel zu bilden. Diese Membranumformung erfordert eine mechanische Kraft, die durch viele endozytotische Proteine und das polymerisierende Aktin-Zytoskeletts bereitgestellt wird. Um mechanistisch zu verstehen, wie die endozytotische Proteinmaschinerie Kräfte für die Membranumformung erzeugt und anwendet, müssen zwei kritische Bereiche erforscht werden: (i) Die Proteinorganisation der endozytotische Stelle muss in einem molekularen Detail beschrieben werden, (ii) die endozytotischen Kräfte müssen in vivo gemessen sein und die beteiligten Proteine und physikalischen Faktoren bestimmt werden. Daher haben wir die Proteinorganisation der endozytotischen Maschinerie mittels FRET-Mikroskopie in der Hefe Saccharomyces cerevisiae charakterisiert. Wir untersuchten die paarweisen Proximitäten von 18 konservierten endozytotischen Proteinen und verwendeten Clathrin und andere Proteine als molekulare Maßstäbe, um eine hochauflösende Proteinkarte der endozytotische Stelle zu erhalten. Wir verfolgten die Reorganisierung endozytotischen Proteine während der Membraninvagination und ihre Bindungsdynamik an der endozytotischen Stelle. Wir zeigen, dass die Proteine des endozytotisches Mantels nicht auf das Clathrin-Gitter beschränkt sind, sondern verschiedene funktionelle Schichten darüber und darunter bilden. Zur Messung der durch Aktin erzeugten Kräfte während der Endozytose verwendeten wir FRET-basierte Sensoren, die in das wichtigste kraftübertragende Protein Sla2 eingebaut wurden. Wir haben eine Kraft von mindestens 8 pN gemessen, die über das Sla2-Molekül übertragen wird, also möglicherweise mehr als die 300-880 pN, die für die endozytotische Vesikelbildung erforderlich sind. Wichtig ist, dass eine Verringerung des Turgordrucks der Zelle und der Spannung der Plasmamembran die über das Sla2 übertragene Kraft reduzierte. Die Charakterisierung der endozytotischen Proteinarchitektur und die Quantifizierung der angewandten Kräfte werden es nun ermöglichen, ein mechanistisches Bild des konservierten endozytotischen Prozesses zu zeichnen. Dies ist von entscheidender Bedeutung für das biomechanische Verständnis der endozytotischen Membranumformung, die potenziell auch auf andere zelluläre Membranumformungsprozesse (Membranverkehr, Zellmorphogenese, Pathogeninvasion usw.) und für viele biomedizinische und biotechnologische Anwendungen (Aufnahme biologisch aktiver Partikel, z.B. Nanopharmazeutika, usw.) anwendbar ist.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Epsin and Sla2 form assemblies through phospholipid interfaces. Nature Communications, 9(1).
  Garcia-Alai, Maria M.; Heidemann, Johannes; Skruzny, Michal; Gieras, Anna; Mertens, Haydyn D. T.; Svergun, Dmitri I.; Kaksonen, Marko; Uetrecht, Charlotte & Meijers, Rob
  
• Mechanobiology of endocytic vesicle formation analyzed by Sla2 force sensors. Molecular Biology of the Cell 26:315
  Abella M., Andruck L. S., Malengo G., Sourjik V. & Skruzny M.
  
• The functional architecture of the endocytic coat analyzed by FRET. Molecular Biology of the Cell 26:316
  Skruzny M., Pohl E., Gnoth S., Malengo G. & Sourjik V.
  
• FRET Microscopy in Yeast. Biosensors, 9(4), 122.
  Skruzny, Michal; Pohl, Emma & Abella, Marc
  
• The protein architecture of the endocytic coat analyzed by FRET microscopy. Molecular Systems Biology, 16(5).
  Skruzny, Michal; Pohl, Emma; Gnoth, Sandina; Malengo, Gabriele & Sourjik, Victor
  
• Actin-generated force applied during endocytosis measured by Sla2-based FRET tension sensors. Developmental Cell, 56(17), 2419-2426.e4.
  Abella, Marc; Andruck, Lynell; Malengo, Gabriele & Skruzny, Michal
  
• Structure of the endocytic adaptor complex reveals the basis for efficient membrane anchoring during clathrin-mediated endocytosis. Nature Communications, 12(1).
  Lizarrondo, Javier; Klebl, David P.; Niebling, Stephan; Abella, Marc; Schroer, Martin A.; Mertens, Haydyn D. T.; Veith, Katharina; Thuenauer, Roland; Svergun, Dmitri I.; Skruzny, Michal; Sobott, Frank; Muench, Stephen P. & Garcia-Alai, Maria M.
  
• The endocytic protein machinery as an actin-driven membrane-remodeling machine. European Journal of Cell Biology, 101(4), 151267.
  Skruzny, Michal