Regulation des Guanine nucleotide exchange factors DOCK1 durch Interaktion von Leukämiezellen mit der Knochenmarknische: Funktions- und Signalweg-Analyse bei der akuten myeloischen Leukämie

• Antragstellerin: Privatdozentin Jasmin Wellbrock, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 324636869

Leukämiestammzellen (LSCs, leukemic stem cells) bilden das Reservoir für die Masse der Leukämiezellen bei der akuten myeloischen Leukämie (AML). LSCs befinden sich bevorzugt in der sog. Stammzellnische, die im Knochenmark von Endothelzellen, Osteoblasten u.a. gebildet wird. Durch Interaktionen mit diesen Stromazellen sind die LSC z.B. gegenüber Chemotherapie geschützt, so dass sie als Auslöser für die hohen Rückfallquoten der AML-Patienten gelten. Bislang sind noch viele der Interaktionen zwischen Leukämie- und Nischenzellen unbekannt.In Vorversuchen mit Co-Kultur-Experimenten von frischen humanen Leukämiezellen und Osteoblasten bzw. Endothelzellen identifizierten wir mittels Arrayanalysen ein Protein, das in Leukämiezellen im Gegensatz zu normalen CD34+-Zellen nach Kontakt mit Stromazellen heraufreguliert wird. Dabei handelt es sich um den Guanine nucleotide exchange factor DOCK1. Das Phänomen der DOCK1-Induktion konnte in weiteren Verifizierungsversuchen sowohl in AML-Zelllinien als auch primären Leukämiezellen von AML-Patienten bestätigt werden. Die klinische Relevanz einer DOCK1-Expression konnten wir durch Analyse einer mRNA-Expressionsdatenbank von ca. 300 AML-Patienten, die eine Standardchemotherapie erhalten hatten, belegen. Die Patienten mit erhöhter DOCK1-Expression zeigten im Vergleich zu denen mit niedriger DOCK1-Expression ein schlechteres Gesamtüberleben. Die Hemmung von DOCK1 mit dem spezifischen Inhibitor CPYPP führte in vitro zu einer dosisabhängigen Reduktion der Proliferation von primären AML-Blasten und AML-Zelllinien, was eine neue zielgerichtete Therapiemöglichkeit der AML aufzeigt.In dem geplanten Projekt soll daher zum einen die DOCK1-Signalkaskade in AML-Zellen im Detail untersucht werden und darüber hinaus die Bedeutung von DOCK1 als therapeutisches Target evaluiert werden. Im ersten Teil des Projektes soll der Einfluss des DOCK1-Inhibitors CPYPP auf das Phosphorylierungsmuster von DOCK1 durch Massenspektrometrie (SILAC-Markierung, DOCK1-Immunpräzipitation, LC-MS/MS-Analyse) ermittelt werden. Mit dem Verfahren sollen zudem potentielle Bindungsproteine von DOCK1 identifiziert werden, was dazu beitragen soll, die DOCK1-Signalkaskade in AML-Zellen aufzudecken. In zweiten Teil des Projektes soll DOCK1 als therapeutisches Target analysiert werden. Hierbei sollen funktionelle Tests, wie Rac-1-Aktivitäts-, Proliferations- oder Colony-Formation-Assays in An- und Abwesenheit des Inhibitors CPYPP bei AML-Zelllinien sowie primären AML-Blasten durchgeführt werden. Als Ergänzung soll bei AML-Zelllinien mit endogener DOCK1-Expression zudem der Effekt eines gezielten shRNA-vermittelten DOCK1-Knockdowns in funktionellen Analysen ermittelt werden. Um die Bedeutung von DOCK1 innerhalb der Knochenmark-Nische näher zu studieren, planen wir ein Leukämie-Mausmodell mit paralleler Transplantation von CRISPR/Cas9-generierten DOCK1-Knockout- sowie Wildtyp-AML-Zellen und anschließender immunhistologischer Darstellung der Knochenmarknische.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Walter Fiedler