Regulation der Aktivierung des menschlichen Spleißosoms

• Antragsteller: Dr. Tonio Schütze
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 324935866

Protein-kodierende Gene von höheren Eukaryoten enthalten typischerweise mehrere nicht-kodierende intervenierende Sequenzen (Introns), die von kodierenden Regionen (Exons) flankiert werden. Spleißen, das Herausschneiden von Introns bei gleichzeitigem Zusammenfügen der Exons, wird durch Spleißosomen katalysiert, die aus vorgeformten Einheiten (snRNP) und über 100 zusätzlichen Proteinen bestehen. Der Zusammenbau des Spleißosoms geschieht de novo auf jedem Intron, wobei das Spleißosom kurze Spleißstellen erkennt. Mehr als 90% der menschlichen Gene weisen Alternatives Spleißen (AS), die differenzielle Verwendung von bestimmten Spleißstellen, auf. Zellen müssen demnach in der Lage sein, die Auswahl der "richtigen" Spleiß-Stelle in Reaktion auf die zellulären Bedürfnisse zu ändern. Konstitutive Exons, die in jedem vorkommen, haben stärkere Spleißstellen, während "alternative" Exons schwächere Spleißstellen haben. Es gibt jedoch nur sehr subtile Unterschiede zwischen Substraten mit optimalen und suboptimalen Spleißstellen. Dementsprechend hat das Spleißosom Proofreading-Mechanismen entwickelt, um funktionales Spleißen zu gewährleisten.Fehlerhaftes Spleißen, das beispielsweise durch Krebs-Mutationen von Kernkomponenten der Spleißmaschinerie verursacht wird, kann zu globalen alternativen Spleißen-Mustern führen. Der molekulare Mechanismus dafür ist nicht gut verstanden. Meine Hypothese ist, dass in Menschen Qualitätskontrolle in Form von Proofreading-Mechanismen während der Aktivierung des Spleißosoms stattfindet. Dies ist eine wichtige Komponente der Spleißstellenauswahl, die von Proteinen, die spezifisch während der Aktivierung vorkommen, sowie von den RNA-abhängigen ATPasen Prp28, Brr2 und Prp2 reguliert werden. Diese Qualitätskontrolle ist besonders bei schwachen Spleißstellen im Zusammenhang mit AS wichtig.Um die Hypothese zu testen, werde ich Next Generation Sequencing (NGS) verwenden, um die Spleiß-Muster der zellulären RNA zu bestimmen, wenn die Expression der Proteine, die ich untersuche, modifiziert ist. Es ist von Vorteil, dass ich dabei auch auf hochmoderne Nanoporen-Sequenzierung zurückgreifen kann. Dabei werden längere Teilabschnitte der DNA erhalten, was es erleichtert, bekannte und neue Isoformen von Genen zu identifizieren. Zur Ergänzung der Sequenzierungsstudien werde ich ein in vitro Spleißsystem verwenden, um festzustellen, ob Spleißen durch die durchgeführten Modifikationen beeinflusst wird. Ein Vergleich der verschiedenen daraus resultierenden Phänotypen in Kombination mit biochemischen Untersuchungen wird mir erlauben, neue molekulare Details für diese späten Stadien des Spleißens aufzuklären.Diese Experimente werden dazu beitragen, ein besseres Verständnis der Spleißstellenauswahl zu erhalten, was nicht nur zu einem großen Erkenntnisgewinn führt, sondern auch enormes medizinisches Potenzial hat, da nach Schätzungen mindestens 25% aller menschlichen Krankheiten mit Mutationen verknüpft sind, die zu fehlerhaften Spleißen führen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeberin: Professorin Dr. Melissa Jurica