Untersuchung elternspezfischer Effekte beim Retinoblastom in einem in vitro Stammzellmodell

• Antragstellerin: Dr. Deniz Kanber, seit 5/2020
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 325511214

Die Inaktivierung beider Allele des RB1-Gens ist ursächlich für die Entstehung eines Retinoblastoms, einem kindlichen Tumor der Retina. Das humane RB1-Gen unterliegt dem epigenetischen Prozess des genomischen Imprintings. Dies führt dazu, dass RB1 vom mütterlichen Allel stärker exprimiert wird als vom väterlichen. Die Abschwächung der RB1-Expression auf dem väterlichen Allel wird auf die Expression einen alternativen Transkripts, RB1-E2B, zurückgeführt. RB1-E2B wird spezifisch nur auf dem väterlichen Allel exprimiert, da sein Promoter (CpG85) auf diesem Allel nicht methyliert ist. Obwohl RB1 also eltern-spezifische Unterschiede in der Genexpression zeigt, sind bisher nur wenige Mutationen beschrieben worden, für die es in der Tumorentstehung einen Unterschied macht, ob die erste Mutation auf dem mütterlichen oder väterlichen Allel liegt. Dabei erhöht eine erste Mutation auf dem väterlichen Allel die Wahrscheinlichkeit für ein Retinoblastom. Wir nehmen an, dass die molekularen Mechanismen des genomischen Imprintings für die Ausprägung eines Elterneffekts beim Retinoblastom verantwortlich sind. Durch die Aufklärung der zugrundeliegenden molekularen Prozesse können wir verstehen warum ein und dieselbe Mutation auf dem mütterlichen Allel zu einem milden Phänotyp, auf dem väterlichen Allel aber zu einem Tumor führt. In diesem Antrag soll die Funktion des alternativen Transkripts, RB1-E2B, aufgeklärt werden. Da RB1-E2B nur vom väterlichen RB1-Allel exprimiert wird, postulieren wir, dass es eine Rolle in der Ausprägung der elternspezifischen Effekte beim Retinoblastom spielt. Das Retinoblastom entsteht aus Zellen der neuralen Retina. Diese Zellen werden wir in vitro durch die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen herstellen. Allerdings hat dieses Modell zwei Limitierungen: RB1-E2B ist generell nur schwach exprimiert und in Stammzellen ist der Promoter von RB1-E2B durch Methylierung auf beiden Allelen ausgeschaltet. Deshalb werden wir in den Stammzellen den RB1-E2B Promoter, durch den starken, konstitutiv aktiven Promoter des humanen EEF1A1-Gens ersetzen. In diesen Zellen können wir dann untersuchen, wie RB1-E2B die Expression des normalen RB1-Transkriptes beeinflusst und ob RB1-E2B in ein verkürztes RB1-Protein translatiert werden kann. In einem nächsten Schritt wird in diese, bereits modifizierten Zellen, die Mutation IVS6+1G>T eingeführt. Diese Mutation zeigt den stärksten elternspezifischen Effekt, der bisher beschrieben wurde. Beide genetische Modifikationen werden mittels des CRISPR/Cas9-Systems vorgenommen. Durch die in vitro Differenzierung in neurale Retina können wir herauszufinden, ob diese Mutation im Zusammenspiel mit RB1-E2B einen Einfluss auf die Zell-Zusammensetzung der neuralen Retina hat. So kann mit Hilfe des Stammzell-Modells die Auswirkung einer elternspezifisch-wirkenden Mutation im Kontext von RB1-E2B in den Ausgangszellen des Retinoblastoms untersucht werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Ehemalige Antragstellerin: Professorin Dr. Laura Steenpaß, bis 4/2020