Synthetische Naturstoffbiosensor - Design, Konstruktion und Anwendung

• Antragsteller: Professor Dr. Andriy Luzhetskyy
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 326726704

Aktinobakterien sind grampositive Bakterien, die eine bemerkenswert hohe Anzahl von Naturstoffen produzieren, welche in der Medizin und Landwirtschaft von höchster Bedeutung sind. Normalerweise sind die produzierten Mengen allerdings so gering, dass sie die biologische Aktivitätsprüfungen oder anderen Anwendungen nicht ausreichen. Zusätzlich werden viele der Naturstoffe unter Laborbedingungen gar nicht produziert. Für eine ausreichende Erhöhung der produzierten Naturstoffmengen und die Aktivierung von unter Laborbedingungen nicht-produzierenden Genclustern benötigen wir einen Weg, um mit Hilfe von Hochdurchsatz-Screening geeignete Klone zu identifizieren. Für die Produktion von kleinen Molekülen ist die vielversprechendste Lösung des Screening-Problems die Verwendung der Biosensor-Technik. Typische Biosensoren sind aus regulatorischen Proteinen aufgebaut (Signaleingang), die in Kombination mit einem spezifischen Liganden die Transkription eines Reportergens (Signalausgang) steuern. Solche Konstrukte, spezifisch für Mevalonat, Succinat und Aminosäuren, wurden erfolgreich für die Optimierung von Escherichia coli und Corynebacterium-Stämmen eingesetzt.Mit dem hier vorgestellten Projekt werden wir die grundlegenden Regeln für die Konstruktion von biologischen Sensorelementen für die Detektion von Sekundärmetaboliten in Aktinobakterien etablieren. Pamamycine sind eine Gruppe von eng verwandten Polyketiden, die von Streptomyces alboniger DSM40043 hergestellt werden und eine bemerkenswerte antibiotische Aktivität gegen multi-resistente Vertreter von Mycobacterium tuberculosis aufweisen. Sammeln sich Pamamycine in S. alboniger Zellen an, so werden sie aus den Zellen exportiert. Dieser Prozess wird durch den TetR ähnlichen Transkriptionsregulator PamR2 gesteuert. Wir haben PamR2 bereits erfolgreich für die Konstruktion eines Prototyps für die in vivo Detektion von Pamamycinen verwendet. Anschliessend haben wir die Kristallstruktur von PamR2 in seiner Apoform und auch als Komplex mit Pamamycin 607 bestimmt. Wir werden die neuen Strukturdaten als Grundlage für eine starke Verbesserung unseres Detektionsprototypen nutzen. Dieser wies in Bezug auf Spezifizität und Sensitivität noch erheblich Mängel auf. Wir werden uns dabei zunächst auf zwei Dinge konzentrieren: 1. Wir werden die Pamamycin Bindetasche von PamR2 so verändern, dass spezifisch bestimmte Pamamycin Subtypen gebunden werden. Dieser Schritt wird das Hintergrundrauschen auf der Signaleingangsebene deutlich reduzieren. 2. Wir werden Operatorsequenzen identifizieren, die sich gezielt mit synthetischen actinobakteriellen Promotoren kombinieren lassen. So werden wir die Signalausgabe unseres Systems signifikant verbessern. Sobald wir unser neuartiges Pamamycin Biosensor System etabliert und die Veränderungen, die zu einem sensitiven und spezifischen Signal führen, verstanden haben, werden wir es als Basis für die Konstruktion künstlicher Biosensoren für neue Sekundärmetaboliten nutzen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen