Pathomechanisms inducing aberrant self-renewal and chemoresistance in GPR56high DNMT3A, NPM1, and FLT3-ITD triple mutated acute myeloid leukemia.
Final Report Abstract
Bei der akuten myeloischen Leukämie, bei der keine zytogenetischen Aberrationen identifiziert werden können (zytogenetisch normale (CN)-AML), ist das Wissen über molekulargenetische Veränderungen von besonderer Bedeutung, sowohl für die Risikoeinschätzung, als auch für therapeutische Entscheidungen. DNMT3A, NPM1, und FLT3 gehören zu den am häufigsten mutierten Genen in dieser AML-Subgruppe und sind daher in Einzelstudien bereits gut untersucht. Allerdings ist nur wenig bekannt über das gleichzeitige Auftreten aller drei Mutationen (im Folgenden tripel-mutierte AML genannt). Das Ziel unseres Projektes war daher, die zugrundeliegenden kooperativen Ereignisse in dieser genetischen AML-Gruppe zu entschlüsseln, um neue Zielstrukturen für die antileukämische Therapie zu identifizieren. Wir führten komplexe Transkriptomanalysen der acht verschiedenen genetischen Subgruppen (verschiedene Kombinationen der genannten Mutationen) durch. Parallel und vergleichend untersuchten wir Leukämiestammzell (LSC)-angereicherte versus LSC- depletierte Fraktionen aus primären AML Proben. Durch diese Analysen identifizierten wir eine Gruppe von Genen und insbesondere Transkriptionsfaktoren, die im Vergleich zu gesunden hämatopoetischen Stammzellen zusammen und daher aberrant in tripel-mutierter AML hochreguliert sind. Der Transkriptionsfaktor Hepatic Leukemia Factor (HLF) zeigte dabei das auffälligste Expressionsmuster, da nahezu keine Expression in AML Proben detektiert werden konnte, die nur eine der drei Mutationen aufwiesen. Im gesunden hämatopoetischen System ist HLF nur in Stamm- und Progenitorzellen exprimiert, nicht jedoch in differenzierteren Blutzellen. In unseren epigenetischen Analysen beobachteten wir, dass bei Patienten mit einer DNMT3A R882-Mutation die CpG-Hypomethylierung an der HLF Transkriptionsstartstelle mit einer hohen HLF mRNA Expression korrelierte, so dass vermutet werden kann, dass dieser eigenetische Mechanismus zur Hochregulierung von HLF in tripel-mutierter AML beiträgt. Zusammenfassend legten diese Beobachtungen nahe, dass HLF ein Schlüsselgen in der tripel-mutierten AML sein könnte. In unseren funktionellen Experimenten konnten wir zeigen, dass der Verlust von HLF über CRISPR/Cas9 das CD34+GPR56+ LSC-Kompartiment von primären humanen tripel-mutierten AML-Zellen in seriellen Xenotransplantationen signifikant reduzierte. Über weitere funktionelle Tests fanden wir heraus, dass HLF Knockout (KO) Zellen schneller den Zyllzyklus durchlaufen als Kontrollzellen, wenn sie frisch von Mäusen isoliert wurden. Bei Reexposition in in vitro Kulturbedingungen erschöpfte sich die Expansionsfähigkeit der HLF KO Zellen jedoch signifikant schneller im Vergleich zu den Kontrollzellen. Über RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) von primären humanen AML-Zellen nach shRNA-vermitteltem HLF Knockdown identifizierten wir Hairy And Enhancer Of Split 1 (HES1) und den Zellzyklus Kinase-Inhibitor CDKN1C/p57 als neue Zielgene von HLF. Von beiden Genen ist bekannt, dass sie für die Zellzyklus Eigenschaften von Stammzellen essentiell sind. Hohe HLF Expression korrelierte darüber hinaus mit einem schlechten Gesamt- und rezidivfreien Überleben. In unseren Experimenten konnten wir passend dazu zeigen, dass HLF KO Zellen sensitiver waren gegenüber hohen Dosierungen von Standard Chemotherapeutika. Diese Daten konnten bereits hochrangig publiziert werden. Parallel etablierten wir verschiedene Kombinationen von Mausleukämiemodellen mit alleiniger oder Ko-Mutation von NPM1c, DNMT3A, und FLT3-ITD. Interessanterweise sehen wir auch hier, dass die Präsenz aller drei Mutationen nach seriellernicht zu einer schnelleren, sondern eher langsamer proliferierenden Leukämie führt. Diese genetisch definierten Mausleukämiemodelle werden aktuell für präklinische in vivo Experimente verwendet, um neue therapeutische Ansätze für die chemoresistente tripel-mutierte AML zu entwickeln. Insgesamt liefern unsere Daten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der kooperierenden Ereignisse in AML mit gemeinsamen Mutationen in NPM1, DNMT3A, und FLT3 und etablieren HLF als essentiellen LSC-Regulator in dieser genetisch definierten Hochrisiko-AML-Gruppe.
Publications
- 2019. Hepatic leukemia factor is a novel leukemic stem cell regulator in DNMT3A, NPM1, and FLT3-ITD triple-mutated AML. Blood 134, 263–276
Garg, S., Reyes-Palomares, A., He, L., Bergeron, A., Lavallée, V.-P., Lemieux, S., Gendron, P., Rohde, C., Xia, J., Jagdhane, P., Müller-Tidow, C., Lipka, D.B., Imren, S., Humphries, R.K., Waskow, C., Vick, B., Jeremias, I., Richard- Carpentier, G., Hébert, J., Sauvageau, G., Zaugg, J.B., Barabé, F., Pabst, C.
(See online at https://doi.org/10.1182/blood.2018862383)
