Metabolische, biochemische und molekulare Untersuchungen zur Bedeutung spezifischer früher Stoffwechselveränderungen im hepatozellulären apoptotischen Prozess
Final Report Abstract
Das Absterben von Leberzellen durch Apoptose (auch bekannt als programmierter Zelltod) tritt im Zusammenhang vieler Lebererkrankungen auf. Der Zelltod durch Apoptose verändert konsequenterweise auch den Energiestoffwechsel der betroffenen Zellen. Während regulatorische Parameter auf molekularer Ebene Gegenstand zahlreicher Forschungen waren und noch sind, fanden mögliche Veränderungen spezifischer Stoffwechselwege während der Apoptose bisher wenig Beachtung bzw. wurden auch nicht ursächlich in den apoptotischen Prozess mit einbezogen. Ziel dieses Forschungsprojekts war es, Veränderungen im Energiemetabolismus die während der Apoptose auftreten zu beschreiben, mögliche Anknüpfungspunkte zur therapeutischen Intervention zu finden und zudem zugrundeliegende mechanistische Erklärungen auf zu decken. Als Apoptosemodell wurden männliche Balb/C-Mäuse venwendet, in deren Leber hepatozelluläre Apoptose mit dem anti-Fas-Antikörper induziert wurde. Nach intraperitonelaer Injektion des Antikörpers (10μg/20g Körpergewicht) starben die Mäuse nach ca. 8 Stunden an Leberversagen. Der apoptotische Prozess wurde anhand verschiedener biochemischer und molekularbiologischer Parameter charakterisiert und es wurde ein zeitlicher Ablauf bestimmter apoptotischer Ereignisse erstellt. Die untersuchten Parameter waren: Serum Alanin-/Aspartat-Aminotransferase, „truncated' BID/BID, reduziertes/oxidiertes Glutathion, Caspase-3-Enzymaktivität und histologische Untersuchungen. Messungen des Glukosestoffwechsels mittels multi-nuklearer Magnetresonanzspketroskopie (NMR) offenbarten spezifische frühe Veränderungen des Energiemetabolismus nach der Apoptoseinduktion. Es wurden erhöhte Flüsse durch den Krebszyklus beobachtet. Zudem trat der veränderte Metabolismus auf, bevor sich die pathophysiologische Parameter änderten. Als selektive therapeutische Maßnahme wurde eine Vorbehandlung der Mäuse mit 50 mg/kg Ciclosporin A vorgenommen, um festzustellen, ob eine Umkehr der zuvor beobachteten Stoffwechselveränderungen zur Verhinderung der Apoptose führen kann. Es wurde gezeigt, dass Ciclosporin A eine inhibierende Wirkung auf den gesamten apoptotischen Prozess hat und dass auch die Erhöhungen der Energieflüsse durch eine Vorbehandlung mit Ciclosporin A verhindert wurden. Im Laufe des Projekts kristallisierte sich jedoch überraschenderweise heraus, dass dieselben Effekte mit dem Vehikel Cremophor® EL der Ciciosporin-Formulierung („Sandimmune i.v.") erzielt werden konnten. Neben den in vivo Experimenten wurde in vitro an primären Hepatozyten der Maus versucht, die in vivo-Ergebnisse zu reproduzieren und anhand der Zellkulturen eingehendere mechanistische Untersuchungen durchzuführen. Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Apoptose in den Zellkulturen und wegen Problemen bei den NMR-Untersuchungen konnten im Rahmen dieses Forschungsstipendiums jedoch keine der ursprünglich geplanten mechanistischen Untersuchungen vorgenommen werden. Die in vitro Versuche wurden daraufhin modifiziert und es konnte stattdessen eine Methode zur Untersuchung des Energiemetabolismus an primären Hepatozyten mittels der 13C-markierten Substrate [2-13C] und [3-13C]Pyruvat etabliert werden. Diese Methode wurde angewendet bei der Suche nach Alternativen zu Ciclosporin A. Dexamethason war diesbezüglich ein vielversprechender Kandidat und es wurde gezeigt, dass Dexamethason sowohl die anti-Fas-induzierte Apoptose inhibiert, als auch Veränderungen des Glukosestoffwechsels in primären Hepatozyten hervorruft. Dabei induzierte eine Behandlung mit Dexamethason Stoffwechselwege, die mit erhöhter Glukoneogenese assoziiert sind. Die Ergebnisse dieses Forschungsstipendiums haben gezeigt, dass zuvor unbekannte Verknüpfungen zwischen dem apoptotischem Prozess und dem Energiestoffwechsel existieren. Der Ansatz zur Intervention auf metabolischer Ebene, um dadurch ebenfalls Einfluss auf den apoptotischen Prozess zu nehmen, war nur bedingt erfolgreich. Dass jedoch prinzipiell eine Einflussnahme möglich ist, konnte deutlich belegt werden.
