Identifizierung und Charakterisierung von RNA cis-Elementen und Nuklease für die 5'-Prozessierung mitochondrialer RNAs in Arabidopsis thaliana

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Binder
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 329858338

In Arabidopsis thaliana werden die 5'-Enden der meisten mitochondrialen RNAs posttranskriptional durch Prozessierung erzeugt. Wir haben mehrere RNA-Prozessierungsfaktoren (RPF) identifiziert, die für eine effiziente 5'-Prozessierung verschiedener RNAs notwendig sind. Diese Faktoren gehören zu den Pentatricopeptide Repeat Proteinen, die aus kanonischen P-Motiven bestehen und keine enzymatische Aktivität besitzen. Darüber hinaus gehören viele dieser Faktoren zur Gruppe der RESTORER of FERTILITY-LIKE-Proteine, was die enge mechanistische Beziehung zwischen der 5'-Prozessierung und der Wiederherstellung der Fertilität bei Kreuzungen mit cytoplasmatisch männlich sterilen Linien belegt. RPFs binden sequenzspezifisch an ihre Ziel-RNAs und dirigieren damit eine bis dato unbekannte Ribonuklease zur den Schnittstellen. Diese potentiellen Bindungsstellen können vorhergesagt werden, sind jedoch bisher nicht experimentell untersucht. Zudem ist bislang nichts über die postulierte Ribonuklease der 5'-Prozessierung bekannt. Diese beiden noch nicht geklärten Aspekte der 5'-Prozessierung sollen nun untersucht werden.In dem vorgeschlagenen Projekt sollen die cis-Elemente für RPF3 und RPF6 charakterisiert werden. Beide Faktoren sind an der Prozessierung von ccmC-mRNAs beteiligt, die von zwei verschiedenen mitochondrialen ccmC-Genotypen stammen. Diese Genotypen werden anhand eines 66 bp langen DNA-Segments unterschieden, das für die 5'-Prozessierung essentielle Sequenzen enthält. Dieses Segment liegt stromaufwärts der zwischen den Genotypen verschiedenen 5'-Enden der ccmC-Transkripte. Crosslink-Immunopäzipitationsexperimente mit den photoaktivierbaren Ribonukleosiden (PAR-CLIP) und Electrophoretic-Mobility-Shift-Assays sollen die cis-Elemente der beiden Proteine exakt kartieren und für die Bindung wichtige Nukleotide identifizieren. Der zweite Schwerpunkt des Vorhabens konzentriert sich auf die putativen mitochondrialen Nukleasen MNU1 und MNU2, die an der 5'-Prozessierung mitochondrialer RNAs beteiligt sind. Diese Studien sehen Tests mit rekombinanten Proteinen vor, um die exakte RNase-Aktivität von MNU1 und MNU2 zu bestimmen. Epitop-markierte Varianten von MNU1 und MNU2 sollen weitere Informationen über die Funktionen dieser Proteine und ihren verschiedenen Domänen in vivo liefern. Ferner soll die Interaktion zwischen den beiden Proteinen und zwischen den MNUs und anderen Faktoren untersucht werden und PAR-CLIP-Experimente sollen die RNA-Bindungsstellen von MNU1, MNU2 und RPF2 identifizieren. RPF2 ist zusammen mit MNU1 und MNU2 an der 5'-Prozessierung der nad9-mRNA beteiligt.Das Projekt soll einen substantiellen Beitrag zum Verständnis der 5'-Prozessierung mitochondrialer RNAs leisten. Darüber hinaus könnte das Vorhaben auch wichtige Rückschlüsse auf den verwandten Prozess der Wiederherstellung der Fertilität bei Kreuzungen mit cytoplasmatisch männlich sterilen Linien erlauben. Diese werden bei der Herstellung von F1-Hybridsaatgut eingesetzt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen