Myosinmutationen bei der familiären hypertrophen Kardiomyopathie. Untersuchung von funktionellen Effekten durch Einzelmolekülexperimente

• Antragstellerin: Privatdozentin Mamta Amrute, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 331024164

Punktmutationen in der schweren Kette des kardialen beta-Myosins (beta-MHC) sind die häufigste Ursache von familiärer hypertropher Kardiomyopathie (FHC) bei Menschen. Obwohl bisher viele verschiedene Mutationen in der Kopfdomäne des Myosins und in anderen sarkomerischen Proteinen identifiziert wurden, sind die pathogenen Zusammenhänge, die den einheitlichen Phenotyp von FHC erzeugen, noch unklar. Bei den FHC-Mutationen im Myosinkopf vermuten wir, daß sie Veränderungen in der motorischen Aktivität umfassen, die die Entwicklung des Phenotyps von FHC auslösen. In Folge dessen könnte man annehmen, daß eine selektive Ausbesserung der ursprünglichen Veränderung im funktionellen Verhalten der mutierten Myosinköpfe eine Entwicklung des FHC-Phenotyps verhindern könnte.Die Hauptaufgabe unseres Forschungsprojekts ist umfassendes Verständnis der funktionellen Domänen und der veränderten Kommunikationspfade im Myosinkopf als Folge der Punktmutationen zu erlangen. Ziel des Projekts ist die Charakterisierung der durch FHC-Mutationen verursachten funktionellen Änderungen in der beta-MHC-Kopfdomäne mittels Untersuchung von spezifischen Einflüssen der FHC-Mutationen an Motorproteinen, beispielsweise durch die ATPase-Kinetik, Kraftschlag, Krafterzeugung und Bewegung von Aktinfilamenten. Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigten unter Anderem reduzierte Calciumsensitivität der betroffenen Zellen bei einigen Mutationen, während andere FHC-Mutationen in der Konverterdomäne erhöhte Kontraktionskräfte durch höhere Kopfsteifheit erzeugt haben. Das zeigt die Notwendigkeit der Unterscheidung der stark variierenden Auswirkungen von FHC-Mutationen auf die Myosinfunktion.Bei den meisten FHC-Patienten wird sowohl mutiertes als auch Wildtyp-beta-MHC exprimiert. Durch die Anwendung von Einzelmolekültechniken können wir Proben Molekül für Molekül testen und so sowohl Wildtyp- als auch mutierte Moleküle getrennt und sogar in gemischten Proben untersuchen. Wir untersuchen die ATPase-Kinetik mit Hilfe von Cy3-EDA-ATP Verweil- und Wartezeiten in der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie und in Nullmoden-Wellenleiter-Assays. Wir nutzen optische Pinzetten an einzelnen beta-MHC-Kopfdomänen für die direkte Messung von Parametern wie Krafterzeugung, Kraftschlag und Steifheit ein. Um Einschränkungen durch die begrenzte Verfügbarkeit nativen Proteins von Patienten-/Donor-Biopsien zu vermeiden, generieren wir die beta-MHC-Kopfdomäne mit FHC-Mutationen in humanen Herzmuskelzellen. Der Hauptvorteil bei der Etablierung dieses neuen Expressionssystems ist die korrekte Zusammensetzung der schweren Myosinkette mit der essenziellen und regulatorischen leichten Kette, was wesentlich für den korrekten Vergleich der Funktion des nativen beta-MHC mit der Funktion des rekombinanten Proteins ist. Zusätzlich werden rational konstruierte mutierte Proteine in Herzmuskelzellen generiert, um Kommunikationspfade und ihre Bedeutung für die chemo-mechanische Kopplung im Myosinmotor weiter zu erkunden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen