Visualization of Germinal Center Dynamics and Differentiation of Antibody-Forming Cells in vivo by Multiphoton Microscopy
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Affinitätsreifung von B Zellen bei T-Zell-abhängigen Immunantworten findet in den so genannten Keimzentren der sekundären lymphatischen Organe statt. Dabei handelt es sich um histologisch definierte Strukturen in den B-Zell Follikeln, die man in eine dunkle Zone (dark zone, DZ mit zahlreichen proliferierenden B Zellen) und eine helle Zone (light zone, LZ mit follikulären dendritischen Zellen, die die mit ihren langen Fortsätzen die B Zellen umgeben) aufweisen. Die Rolle, die diese Zonierung bei der Affinitätsreifung spielt, ist unklar, und man weiß nicht, wie die Selektion von B Zellen mit höherer Affinität genau abläuft. Ein klassisches Modell der Keimzentrumsdynamik (cyclic reentry model) besagt, daß die B Zellen in der DZ den Prozeß der somatischen Hypermutation durchlaufen, um dann in der LZ durch ihre Affinität zu auf FDCs gebundenem Antigen selektiert zu werden. Mittels Multiphoton Mikroskopie lassen sich an lebenden Mäusen einzelne Zellen in vivo beobachten. Diese Technik erlaubt die Visualisierung von Strukturen, die sich mehrere hundert μm tief im Gewebe befinden. Durch den Einsatz gewebeschonender Laserquellen kann man das Gewebe über einen relativ langen Zeitraum (mehrere Stunden) beobachten. Man kann dann zelluläre Bewegung, Migration sowie Interaktionen zwischen verschiedenen, fluoreszent markierten Zelltypen im Gewebe von anästhesierten Mäusen analysieren, indem man Filmsequenzen herstellt und diese mit Hilfe von spezieller Software auswertet. Im Gegensatz zu konventioneller Histologie kann man also dynamische Prozesse im Zeitverlauf verfolgen. In diesem Projekt, welches im Labor von Prof. Mark Shlomchik an der Yale University durchgeführt wurde, haben wir mit Hilfe dieser Technik erstmals die Migration von B Zellen in den Keimzentren sowie deren Interaktion mit FDCs untersucht. Es wurde eine Methode entwickelt, mit Hilfe derer sich fluoreszente B Zellen, die spezifisch für das Hapten NP sind, im Keimzentrum verfolgen lassen. Zudem wurden FDCs in vivo fluoreszent markiert, um die Zonierung im Keimzentrum zu visualisieren. Das Keimzentrum stellte sich als eine hochgradig dynamische Struktur dar, der größte Teil der B Zellen war stark motil und von unerwarteter morphologischer Vielfalt. Viele der B Zellen zeigten das sogenannte „Probing" Phänomen, bei dem sie mittels zytoplasmatischer Fortsätze ihre Umgebung abtasteten. Gelegentlich traten naive B Zellen aus dem follikulären Mantel in das Keimzentrum ein. Naive B Zellen bewegten sich weniger gerichtet als Keimzentrums B Zellen. Mittels eigens dafür programmierter Software wurde der Fluß der B Zellen zwischen DZ und LZ ermittelt. Wider Erwarten war der Austausch von Zellen zwischen beiden Bereichen gering. Wir konnten zeigen, daß die Frequenz von B Zellen, die zwischen DZ und LZ hin- und herwandert, nicht ausreichend ist, um das oben erwähnte cyclic reentry Modell zu erklären. Wahrscheinlicher ist ein Modell, in die Selektion in der DZ stattfindet und die positiv selektierten Zellen in der LZ proliferieren. Während des Zeitraumes des Rückkehrstipendiums wurde am Deutschen Rheumaforschungszentrum in Berlin ein Labor für Intravitalmikroskopie aufgebaut. Das bereits im DRFZ vorhandene Multiphoton Mikroskop wurde umgerüstet und für Intravitalmikroskopie tauglich gemacht. Desweiteren wurde eine Technik etabliert, um Plasmazellen im Knochenmark zu visualisieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2007. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity 26:655-667
Hauser, A. E., T. Junt, T. R. Mempel, M. W. Sneddon, S. H. Kleinstein, S. E. Henrickson, U. H. von Andrian, M. J. Shlomchik, and A. M. Haberman
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2007. In vivo imaging studies shed light on germinal-centre development. Nat Rev Immunol 7:499-504
Hauser, A. E., M. J. Shlomchik, and A. M. Haberman
