Der Desoxy-Pyrimidin-Stoffwechsel in pflanzlichen Mitochondrien

• Antragsteller: Dr. Marco Herde
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 342656586

Thymidylate (Mono-, Di-, Triphosphat jeweils dTMP, dTDP, dTTP oder kurz T genannt) sind lebensnotwenig für Organismen, da sie zu einem der vier Bausteine in der DNA führen. Im Gegensatz zur T-Biosynthese in Bakterien ist wesentlich weniger über den T und Pyrimidin-Metabolismus in pflanzlichen Mitochondrien bekannt. Vier verschiedene Quellen für mitochondriales T können unterschieden werden: 1. de-novo-Synthese in Mitochondrien beginnend mit der Methylierung von Desoxy-Uridin-Monophosphat (dUMP); 2. Biosynthese in Mitochondrien beginnend mit der Desaminierung von Desoxy-Cytidin-Triphosphat (dCTP); 3. Recycling von Thymidin in Mitochondrien; 4. Transport von Thymidylaten aus dem Cytosol in Mitochondrien.In Arabidopsis haben wir ein neues Enzym (dCTP-Deaminase) identifiziert, das der menschlichen dCMP Deaminase ähnelt, aber präferenziell dCTP zu dUTP desaminiert und nur geringe Aktivität mit dCMP aufweist. Wir zeigen, dass dieses Enzym in Mitochondrien lokalisiert ist, was eine Beteiligung in der T-Biosynthese in diesem Organell nahelegt. Zusätzlich haben wir zum ersten Mal einer pflanzlichen Nukleotid-Methyltransferase (THY2) biochemisch eine Aktivität (Umsetzung von dUMP in dTMP) zugeordnet und deren mitochondriale Lokalisation gezeigt. Einzelmutanten für dCTP-Deaminase und Doppelmutanten von THY2 mit dem Gen der mitochondrialen Isoform der Thymidin-Kinase wurden identifiziert. Etwa 10% der Individuen der Doppelmutante hatten ein abnormes Wachstum, was zeigt, dass mitochondrialer T-Mangel einen starken Einfluss auf die pflanzliche Physiologie hat.Wir werden die mitochondrialen Desoxy-Nukleotide quantifizieren und die Anzahl der mitochondrialen Genome bestimmen, um Veränderungen im T-Stoffwechsel in diesen Mutanten zu charakterisieren. Verschiedenste Methoden (z.B. Enzym Tests, Next-Generation-Sequencing, LC/MS, CRISPR Technologie) aus der Biochemie, Genetik und Metabolomik werden zur Anwendung kommen, mit dem Ziel den Beitrag von Biosynthese, Recycling und Transport auf die Quantität der mitochondrialen Desoxy-Pyrimidin-Nukleotide zu verstehen.Da dCTP-Deaminase über Desaminierung von dCTP eine Vorstufe von T zu erzeugen kann, ist es möglich, dass das Enzym zusätzlich oder alternativ an der Einstellung der Nukleotid Gleichgewichte im Mitochondrium beteiligt sein könnte und damit zur Reduktion der Mutationsrate beiträgt. Wir planen die mitochondriale Mutationsrate mit einem kürzlich publizierten Protokoll für die Detektion seltener Mutationen zu bestimmen. Dieses Experiment wird aufzeigen, ob, verursacht durch das Fehlen von dCTP-Deaminase, eine Störung des Desoxy-Nukleotid-Gleichgewichts die Mutationsfrequenz erhöhen kann. Zusätzlich werden wir eine mögliche Rolle von dCTP-Deaminase in der Entgiftung von 5-Methyl-dCMP (beschrieben für das Homolog in Menschen) prüfen.Zusammenfassend werden diese Experimente unser Verständnis des mitochondrialen Pyrimidin-Stoffwechsels und dessen Auswirkungen auf die mitochondriale Genomstabilität vertiefen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Claus-Peter Witte