Nanostrukturierung und Dynamik subzellulärer Funktionsdomänen als regulatorische Einheiten der endothelialen Zellkontakte

• Antragsteller: Professor Dr. Hans-Joachim Schnittler
• Fachliche Zuordnung: Anatomie und Physiologie
• Förderung: Förderung von 2006 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 34325042

Dynamische Phänomene wie z.B. die Relativbewegungen von Zellen zueinander, die parazellulären Transmigration von Leukozyten, Tumorzellen oder Pathogenen oder die Angiogenese erfordern eine subzelluläre Regulation der Zellkontakte, deren molekular-strukturelle Grundlagen und Mechanismen weitgehend unbekannt sind. Unsere Daten implizieren, dass, wie bei anderen regulatorischen Einheiten, Endothelzellkontakte aus subzellulären Funktionsdomänen aufgebaut sind. Diese Domänen können als Proteinkomplexe definiert werden, die mit regulatorischen Molekülen assoziieren und lokal regulierbar sind. Die Arbeitshypothese basiert auf folgenden Erkenntnissen: Mit der Superresolution Mikroskopie können wir zeigen, dass der VE-Cadherin/Catenin-Komplex in Form von aneinandergereihten kleinen Proteinklustern an den Zellkontakten vorliegt. Die Kluster können stimulusabhängig fusionieren und die Barrierefunktion steigern. Des Weiteren treiben junction associated intermittent lamellipodia (JAIL), die zwischen den VE-Cadherin Klustern entstehen als separate Funktionseinheiten lokal die VE-Cadherin-Dynamik. Zudem lokalisieren Eps15 und Caveolin-1 neben einzelnen VE-Cadherin Klustern und können damit die Öffnung der Zellkontakte durch Sequestrierung des beta-Catenin lokal regulieren. Wir wollen untersuchen wie subzellulärer Funktionsdomänen nanostrukturell aufgebaut sind und prüfen in wie weit diese Domänen als regulatorische Einheiten endothelialen Zellkontakte lokal regulieren können. In einem ersten Ansatz sollen mit Hilfe der structured illumination micrososcopy (SIM), total interference fluorescence microscopy (TIRFM) und hochauflösender Lokalisationsmikroskopie wie direct stochastic optical reconstruction (dSTORM) und photoactivated localization microscopy (PALM) die Nanostrukturierung der adherens- und tight junctions und deren Interaktion mit Aktinfilamenten und Vimentinfilamenten (IF) im Zellkulturmodell und in vivo charakterisiert werden. In einem zweiten parallelen Ansatz soll die Dynamik der VE-Cadherin Kluster und ihre dynamische Interaktion mit Aktin-und Vimemtinfilamenten untersucht werden. Hierzu stehen Fusionsproteine mit fluoreszierenden bzw. photoaktivierbaren tags (z.B. EGFP, mCherry, HALO, SNAP, DENDRA, EOS) zur Verfügung bzw. werden hergestellt. Die Konstrukte werden dann in unbehandelten oder genetisch manipulierten Endothelzellen über virale Gentransduktion exprimiert und die Dynamik mittels spinning disc confocal microscopy (SDCM) sowie SIM, TIRF und FRAP analysiert. Hochauflösende Lokalisationsmikroskopie (dSTORM, PALM, iPALM) mit einer Auflösung bis maximal 20 nm ergänzen die Untersuchungen nach der Fixierung. Alle für dieses Projekt erforderlichen Techniken und apparativen Voraussetzungen stehen in unserem Labor zur Verfügung. Wir erwarten, dass diese Daten zu neuen und weitergehenden mechanistischen Konzepten zur Barrierefunktionsregulation im Allgemeinen und speziell zur lokalen Regulation der Endothelzellkontakte führen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen