Subzelluläre Verteilung von Proteintranslation und Translokation in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

• Antragsteller: Professor Dr. Nils Johnsson
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 343927390

Subzelluläre Verteilung von Proteintranslation und Translokation in der Hefe Saccharomyces cerevisiaeVon einer kleinen aber stetig wachsenden Gruppe von mRNAs ist bekannt dass sie innerhalb der Zelle dort translatiert werden wo die durch sie kodierten Proteine später wirken. Diese mRNAs tragen positionelle Information in kurzen Sequenzmotiven die von RNA-bindenden Proteinen erkannt und transportiert werden. Das Phänomen lokal synthetisierter Proteine könnte allerdings noch weitaus verbreiteter sein und die Existenz anderer, von RNA-Motiven unabhängiger Mechanismen ihrer Lokalisation ist nicht ausgeschlossen. Proteintranslation und Translokation mit räumlicher Auflösung robust nachzuweisen ist jedoch eine große experimentelle Herausforderung.Wir schlagen drei verwandte Techniken vor, mit denen wir Proteinsynthese und Translokation in der Zelle verfolgen. Alle drei basieren auf der Split-Ubiquitin Methode, bei der die getrennt exprimierten N- (Nub) und C-terminalen Häften (Cub) von Ub zu einem nativ-ähnlichen Protein reassoziieren. In dem ersten Ansatz wird Cub an eine Untereinheit des Ribosoms oder eines Translokationskanals gekoppelt, und das Nub an das Protein, dessen Synthese untersucht wird. mCherry und GFP umrahmen Cub (CCG) und lassen das CCG-gekoppelte Protein gelb leuchten. Sobald die CCG-Fusion die Synthese des Nub Proteins katalysiert, führt die forcierte Nähe zwischen Nub und Cub zu Abspaltung und Abbau des GFP. Als Folge wechselt die Cub Fusion ihre Farbe von gelb nach rot. Die ungleiche zelluläre Verteilung gelb und rot fluoreszierender Moleküle spiegelt demnach die räumlich begrenzte Synthese der Nub Fusion wider.Alternativ messen wir die Nähe zwischen einem Protein und seiner mRNA. Diese Nähe wird nur während der Translation des Proteins am Ribosom beobachtet. Für ihren Nachweis fusionieren wir das CCG Modul an das Protein M2S (M2SCCG), das mit hoher Affinität an RNA-Loops bindet. Diese werden in die 3UTR einer mRNA inseriert, die die Synthese einer Nub-Fusion kodiert. Bei Synthese dieser Fusion induziert die Nähe zur eigenen mRNA die Abspaltung der GFPs von den mRNA-gebundenen M2SCCG Molekülen. Ein lokal erhöhtes Verhältnis von mCherry- zu GFP identifiziert den zellulären Syntheseort der Nub Fusion.Eine simple Rekonfiguration der Methode ermöglicht ferner die Interaktionen zwischen mRNA und Proteinen zu messen und erlaubt durch die Auswahl der Nub-gekoppelten Proteine eine komplementäre Sichtweise von mRNA Targeting und Translation. Die Synthese der aus den drei Ansätzen gewonnenen Ergebnisse wird eine zelluläre Karte der Translation und Translokation ergeben, die genspezifische hot-spots der Proteinsynthese markiert. Wir werden die Techniken zuerst in der Hefe entwickeln und anwenden, da die vorhandenen Ressourcen die Suche nach den für die lokale Synthese verantwortlichen Genen stark beschleunigt. Die Methoden sollten auch in Zellen höherer Eukaryonten unmittelbar einsetzbar sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen