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Projekt
Einfluss der C-Mannosylierung auf die Prozessierung von Protein im endoplasmatischen Retikulum und Darstellung der funktionellen Bedeutung der C-Mannosylierung in Zielproteinen
Antragsteller
Dr. Hendrikus Hans Bakker
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Förderung
Förderung seit 2017
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 289991887
Die C-Mannosylierung von Tryptophanresten ist ein spezifischer Glykosylierungsprozess tierischer Zellen, der im endoplasmatischen Retikulum (ER) stattfindet. Die C-Mannosyltransferase (C-ManT), nutzt Dolichol-Phosphat-Mannose (Dol-P-Man. Dieser aktiviert Zucker ist auch für zwei weitere ER Glykosylierungswege, die N-Glykosylierung und die O-Mannosylierung, essentiell. Während die beiden letztgenannten Glykosylierungsarten umfangreich untersucht wurden, sind der C-Mannosylierungsprozess und die Funktion der C-Mannosylierung an Trägerproteinen praktisch unbekannt. Mit der Klonierung der ersten C-ManT aus C. elegans durch meine Gruppe in 2013 hat sich diese Situation geändert. Hierdurch wurden molekulare, zelluläre und systemische Untersuchungen möglich. C-ManT ist ein Multimembran-Protein, das Verwandtschaft zur katalytischen Untereinheit STT3 des Oligosaccharyltransferase-Komplexes im N-Glykosylierungsweg aufweist. Aufgrund Ähnlichkeiten der Enzyme darf vermutet werden, dass auch mechanistische und funktionelle Ähnlichkeiten zwischen den beiden Glykosylierungsprozessen bestehen. C-Mannosen werden an einer spezifischen Zielsequenz (WxxW) eingeführt. Oft liegt das Motiv als Doppelmotiv vor (WxxWxxW), wobei C-Mannosylierung an allen drei Tryptophanen (W) auftreten kann. Zwei oder drei C-Mannosen könnte biologisch als Äquivalent eines einzelnen N-Glykans gesehen werden da in intermediären Schritten der N-Glykosylierung ähnliche Muster terminaler Mannosen auftreten.Nach Klonierung der C-ManT (DPY-19) aus C. elegans, konnten wir zeigen, dass Säuger vier Homologe besitzen. In unseren jüngsten Studien zeigen wir, dass DPY19L1 die ersten beiden Tryptophane der WxxWxxW Sequenz nutzt, während DPY19L3 den dritten Tryptophanrest des Motivs modifiziert. Über CRISPR-Cas wurden die C-ManTs in CHO Zellen einzeln und in Kombination inaktiviert. Die Nutzung dieser Zelllinien zur Herstellung rekombinanter Proteine mit C-Mannosylierungsmotiven hat die Bedeutung der Modifikation für die Sekretion und Stabilität der Proteine gezeigt. Um die mechanistischen und funktionalen Aspekte der C-Mannosylierung weitergehend zu analysieren, werden zwei Ziele verfolgt: Erstens, werden wir die molekularen Vorgänge im ER in Verbindung mit anderen Glykosylierungsprozessen untersuchen. Zweitens, werden die Target-Spezifität der C-ManTs und die funktionelle Bedeutung der C-Mannosylierung auf verschiedenen Zielproteinen analysiert. Da viele Proteine gleichzeitig Zielstruktur für N-Glykosylierung und C-Mannosylierung sind, werden wir die Hierarchie der Prozesse analysieren. Hierzu sollen neue Zellmodelle etabliert, und die Hierarchie durch in vitro Translation untersucht werden. Darüber hinaus wird die Frage nach möglichen Interaktionspartnern der C-ManT adressiert und an den neu generierten C-Mannosylierungs-defizienten Zelllinien wird die Spezifität der Isoenzyme sowie die Bedeutung der Integrität der C-Mannosylierung für die Funktion von Zielproteinen hinterfragt.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
