Engineering of polymerases for the amplification of damaged DNA: applications in paleobiology, archaeology and forensic medicine
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Starke Inhibitoren limitieren die Nützlichkeit von PCR Assays für eine Vielzahl von Proben. Obwohl zahlreiche Methoden existieren, diese Inhibitoren zu entfernen und die DNA auf die PCR Analyse vorzubereiten, sind diese oft kostenintensiv, zeitaufwendig und es kommt außerdem zu großen Verlusten der Proben-DNA. Dies ist besonders problematisch für Beweismaterial in der Forensik oder auch in der paläontologischen oder archäologischen Forschung, bei der Probenmaterial endlich ist und oft auch der fragile Zustand der Proben eine zusätzliche Aufreinigung verbietet. Der Ansatz des vorliegenden Projektes war daher, neuartige Polymerasen durch CSR (compartmentalized self-replication) zu evolvieren, die eine erhöhte Resistenz gegenüber komplexen Substanzen, wie zum Beispiel Huminsäure oder Bodenproben, zeigen. Diese Substanzen entstehen beim Abbau organischer Materie und finden sich daher oft in aufbereiteten ancient DNA Proben. Dies kann sehr häufig zu einem Versagen der PCR Reaktion führen und die gespeicherte genetische Information der Proben kann nicht analysiert werden. DNA Polymerasen, die weniger empfindlich auf diese Inhibitoren reagieren, können daher die Anzahl untersuchbaren Materials und den Rahmen realisierbarer Experimente erweitern. Es konnten einige Polymerasen isoliert werden, die eine erhöhte Resistenz gegenüber einem spezifischen Inhibitor zeigten, so genannte Spezialisten. Noch interessanter jedoch ist die Identifizierung einer DNA Polymerase (IID9), die eine eindrucksvolle generelle Resistenz gegenüber einer Vielzahl unterschiedlicher Inhibitoren zeigt, inklusive Substanzen mit hochdivergierender Zusammensetzung wie Knochenmehl, Koprolith und Knochenmehl aus einer Teergrube. Diese DNA Polymerase übertrifft den Wildtyp nicht nur in diesen Inhibitor-Analysen, sondern auch unter sehr schwierigen PCR Bedingungen und in der Abwesenheit jeglicher Inhibitoren. Dies konnte am Max-Planck-Institut in Leipzig gezeigt werden, in Versuchen in denen eine limitierende Menge an ancient DNA in den PCR Ansatz gegeben wurde. In dieser Versuchsanordnung kam es deutlich häufiger zu einer Amplifikation durch die IID9 Polymerase als durch den Wildtyp. Ausserdem war die Qualität des PCR Produktes deutlich besser. Die selektierte DNA Polymerase IID9 sollte sich in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten nützlich zeigen, sei es z.B. für die ancient DNA Forschung, verschiedenste Formen der Feldforschung oder in der Forensik.
