Die Bedeutung der bakteriellen Protein-N-Rhamnosylierung verstehen

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Jürgen Lassak
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Analytische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 356237927

Eine der häufigsten Formen der posttranslationalen Proteinmodifikation ist die Kopplung einer Zuckereinheit an die Seitenkette einer Aminosäure, die so genannte Glykosylierung. Die Modifikation wird durch eine Klasse von Enzymen durchgeführt, die als Glykosyltransferasen bekannt sind. Wenn der Zucker kovalent an den Stickstoff der Carbamidgruppe von Asparagin oder die Guanidinogruppe von Arginin gebunden ist, spricht man von N-Glykosylierung. Jüngste Entdeckungen neuer N-Glykosyltransferasen in Bakterien und die Entwicklung modifikationsspezifischer Antikörper weisen auf eine große Vielfalt bisher unbekannter prokaryotischer N-Glykoproteine hin. Ausgehend von unseren Erkenntnissen zur Proteinmonorhamnosylierung wollen wir nun deren Verbreitung in Mikroorganismen genauer untersuchen. Im ersten Teil des Projekts konzentrieren wir uns hierzu auf das Actinobakterium Mycobacterium phlei, welches sich durch ein komplexes und dynamisches ‚Rhamnoproteom‘ auszeichnet. Unser Ziel ist es eine effiziente Methodik zur Anreicherung von monorhamnosylierten Proteinen und deren Analyse mittels Massenspektrometrie zu entwicklen, um erstmalig ein umfassendes und positionsaufgelöstes Bild der Bedeutung der Rhamnosylierung in M. phlei zu erhalten. Um eine möglichst hohe Selektivität und Sensitivität der Analyse zur erreichen werden wir, zusätzlich zu Flüssigchromatographie und hochaufgelöster Flugzeitmassenspektrometrie, die Ionenmobilitätsspektrometrie (TIMS, Trapped ion mobility spectrometry) als weitere Trenndimension einsetzen und für diesen neuen Anwendungsbereich charakterisieren. Zum einen werden wir den Nutzen des Kollisionsquerschnitts zur Identifizierung von rhamnosylierten Peptide untersuchen, und zum anderen werden wir Methoden entwickeln um modifizierte Peptide während der Datenaufnahme anhand ihrer relativen Ionenmobilität zu priorisieren. Im zweiten Teil des Projekts werden wir uns speziell auf Monorhamnosylierungen fokussieren, die von der Glykosyltransferase EarP katalysiert werden. Entgegen ursprünglicher Annahmen ist das Spektrum der Akzeptorsubstrate nicht auf den Translationsfaktor EF-P beschränkt. Unser Ziel ist es daher, die EarP-vermittelte Glykosylierung durch biochemische Untersuchungen und massenspektrometrische Analysen vollständig zu verstehen und das Spektrum der Zielproteine in Pseudomonas putida und Shewanella oneidensis umfassend zu beschreiben. Das gewonnene Wissen über die Promiskuität der EarP-Akzeptorsubstrate wird die Grundlage bilden das Enzym als vielseitig einsetzbares molekulares Werkzeug zur Glykosylierung beliebiger Zielproteine biotechnologisch nutzbar zu machen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen