Su(H) als Ziel der Repression des Notch Signalwegs in Drosophila

• Antragsteller: Dr. Dieter Maier
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 357709120

• Erstellungsjahr: 2021

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Der Notch-Signalweg ist aufgrund seiner Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation und damit verbundenen Krankheiten bei Funktionsverlust von grundlegendem Interesse. Seine hohe Konservierung erlaubt es, Erkenntnisse von Drosophila auch auf den Menschen zu übertragen. Aktivierung des Signalwegs führt zur Abspaltung des intrazellulären Anteils des Transmembranrezeptors Notch (ICN); ICN aktiviert transkriptionell zusammen mit CSL und Koaktivatoren Notch-Zielgene. CSL spielt dabei eine duale Rolle, denn gemeinsam mit Korepressoren werden die Notch-Zielgene reprimiert. In Drosophila wird der Repressorkomplex durch das CSL Homolog Su(H) und Hairless, sowie weiteren Korepressoren, gebildet. Seine Strukturanalyse, sowie die Ermittlung der funktionellen Domänen von H u.a. durch Evolutionsvergleiche mit der weitest entfernten Spezies Daphnia pulex, führten zu weitreichenden neuen Erkenntnissen. Ein zentrales Ergebnis unserer Arbeiten ist der Befund, dass der H-Su(H) Repressorkomplex bereits im Cytoplasma gebildet wird, und als solcher dynamisch in den Kern importiert und exportiert wird. Dies widerspricht der allgemeinen Annahme, dass CSL Proteine auf Notch-Zielgenpromotoren sitzend ihre Kofaktoren binden, wobei Koaktivatoren mit Korepressoren konkurrieren. Im Detail zeigten unseren Analysen, dass die H-Kernlokalisation durch die benachbarten Signale NLS3 und NES vermittelt wird. Zudem konnten wir in mehreren Versuchsansätzen klar belegen, dass Su(H) der subzellulären Lokalisation von H strikt folgt; dies gilt ebenso für das Maushomolog RBPJ. Dabei ist die Su(H) Proteinmenge unabhängig von seiner räumlichen Verteilung. Ein Schlüssel zum Verständnis der Dynamik der Notch-Aktivität ist der Befund, dass Su(H) Protein durch die Rekrutierung in Proteinkomplexe stabilisiert wird, und zwar sowohl durch die Bindung an H als auch an ICN. Dies erklärt die Tatsache, dass Su(H) Mutationen nicht dosissensitiv sind wie solche in H oder Notch, da die Menge an Su(H) Protein stets der seiner Kofaktoren entspricht. Das heißt gleichzeitig, dass H- Protein die Verfügbarkeit von Su(H) beeinflusst. Wir konnten zeigen, dass ungebundenes Su(H) einem proteasomalen Abbau unterliegt, welcher im H-Su(H) Komplex vermindert ist. Wir haben ein Hela-Zellsystem etabliert, in dem die Abhängigkeit der Su(H)-Degradation von der H-Bindung eindeutig nachzuweisen ist. Im Normalfall geht der Degradation eine Ubiquitinierung von Lysinen voraus. Trotz mehrerer Mutationsexperimente konnte das Degron in Su(H) noch nicht ermittelt werden. Als weitere Repressorkomponente wurde Asf1 untersucht. Die molekulare Eingrenzung der Kontaktstelle in H wurde durch eine extrem schwache Interaktion erschwert. Offenbar liegt sie benachbart zur Su(H) Interaktionsdomäne in der hochkonservierten CT-Domäne mit bisher unbekannter Funktion. Die Notch-Gewinnphänotypen gene-engineerter Fliegen mit CT-Verlust unterstützen das Modell einer Rolle von Asf1 im H-Su(H) Repressorkomplex. Diese Arbeiten stehen kurz vor dem Abschluss.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• (2017). Conservation of the Notch antagonist Hairless in arthropods: functional analysis of the crustacean Daphnia pulex Hairless gene. Development Genes and Evolution, 227(5), 339–353
  Zehender, A., Bayer, M., Bauer, M., Zeis, B., Preiss, A., & Maier, D.
  
• (2017). Hairless-binding deficient Suppressor of Hairless alleles reveal Su(H) protein levels are dependent on complex formation with Hairless. PLoS Genetics, 13(5), e1006774
  Praxenthaler, H., Nagel, A. C., Schulz, A., Zimmermann, M., Meier, M., Schmid, H., Preiss, A., & Maier, D.
  
• (2018). Complex genetic interactions of novel Suppressor of Hairless alleles deficient in co-repressor binding. PloS One, 13(3), e0193956
  Preiss, A., Nagel, A. C., Praxenthaler, H., & Maier, D.
  
• (2019). Nucleo-cytoplasmic shuttling of Drosophila Hairless/Su(H) heterodimer as a means of regulating Notch dependent transcription. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research, 1866(10), 1520–1532
  Wolf, D., Smylla, T. K., Reichmuth, J., Hoffmeister, P., Kober, L., Zimmermann, M., Turkiewicz, A., Borggrefe, T., Nagel, A. C., Oswald, F., Preiss, A., & Maier, D.
  
• (2019). The evolution of transcriptional repressors in the Notch signaling pathway: a computational analysis. Hereditas, 156, 5
  Maier, D.
  
• (2019). The Notch repressor complex in Drosophila: in vivo analysis of Hairless mutants using overexpression experiments. Development Genes and Evolution, 229(1), 13–24
  Smylla, T. K., Meier, M., Preiss, A., & Maier, D.
  
• (2020). Limited availability of general co-repressors uncovered in an overexpression context during wing venation in Drosophila melanogaster. Genes, 11(10), 1141
  Nagel, A. C., Maier, D., Scharpf, J., Ketelhut, M., & Preiss, A.
  
• (2020). Membrane-anchored Hairless protein restrains Notch signaling activity. Genes, 11(11), 1315
  Maier, D.
  
• (2021). Nucleo-cytoplasmic shuttling of murine RBPJ by Hairless protein matches that of Su(H) protein in the model system Drosophila melanogaster. Hereditas, 158(1)
  Wolf, D. B., Maier, D., & Nagel, A. C.