Die Rolle der BAP1 Inaktivierung bei der Ausbildung des Tumorklassen-spezifischen Methylierungsmusters beim Aderhautmelanom

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Laura Steenpaß; Dr. Michael Zeschnigk
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 364447667

Das Aderhautmelanom (AM) ist ein Tumor der im Auge entsteht. Basierend auf dem Genexpressionsprofil, dem Chromosom 3 Status und dem Genmutationsmuster können AM in zwei Tumorklassen unterteilt werden. AM die eine Monosomie 3 (M3) aufweisen sind mit einer sehr schlechten, AM mit einer Disomie 3 (D3) mit einer sehr guten Prognose assoziiert. Fast alle AM mit M3 weisen inaktivierende Mutationen im Tumorsuppressorgen BAP1 (BRCA1 associated protein 1) auf. Aufgrund seiner Chromatin-modifizierenden Funktion wird BAP1, das auf 3p21 liegt, als epigenetischer Modifier angesehen. Wir haben das genomweite Methylierungsmuster an DNA von 4 primären AM mittels Bisulfit-Sequenzierung (WGBS) bestimmt. Dadurch konnten wir Regionen bestimmen, die zwischen den beiden AM-Klassen konsistent unterschiedliche Methylierungsmuster aufweisen (differentially methylated regions, DMR).Im aktuellen Projekt möchten wir unter anderem die Methylierungsunterschiede von M3 und D3 AM genauer bestimmen. Insbesondere möchten wir die Methylierungsveränderungen bestimmen, die im Rahmen der Tumorentstehung und -progression entstehen. Hierfür werden wir die genomweite DNA-Methylierung von Melanozyten aus dem Auge mittels WGBS erheben und mit den Methylierungsmustern der primären AM vergleichen. Die regulatorische Bedeutung der Methylierungsveränderungen, werden wir mittels Sequenzierung der mRNA (RNA-Seq) von primären AM bestimmen. Die Expressionsunterschiede der Gene vergleichen wir mit den Methylierungsmuster benachbarter DMRs. In unseren bisherigen Studien fanden wir, dass 25% aller identifizierten DMRs zwischen zwei Transkriptionsstartstellen (TSS) des gleichen Gens lagen. Auf Basis der RNA-Seq Daten wollen wir prüfen, ob die DMR Methylierung Einfluss auf die TSS Nutzung hat. Das übergeordnete Ziel dieses Projekts ist es die Rolle von BAP1 bei der Etablierung der epigenetischen Muster im Rahmen der Tumorentstehung und -progression näher zu beleuchten. Wir möchten prüfen ob eine BAP1 Inaktivierung in AM Zelllinien mit Disomie 3 ausreicht um ein M3 typisches Methylierungsmuster zu generieren. Umgekehrt möchten wir prüfen inwieweit die Wiederherstellung der BAP1 Aktivität in Tumorzellen mit M3 das Methylierungsmuster verändert. Sowohl die BAP1 Inaktivierung in D3 Zelllinien als auch die BAP1 Reparatur in M3 Zelllinien erfolgt mittels Genome editing basierend auf der CRISPR/Cas Technologie. Um den epigenetischen Klassenwechsel zu untersuchen, wollen wir die Methylierunsgsmuster der klassenspezifisch methylierten DMRs vor und nach BAP1 Manipulation bestimmen. Hierfür verwenden wir die Methode der Amplikon Bisulfit-Sequenzierung mit deren Hilfe auch kleine Methylierungsveränderungen zuverlässig bestimmt werden können.Sollten die Ergebnisse zeigen, dass eine BAP1 Inaktivierung zu einer epigenetischen Reprogrammierung führt, so ist es unser langfristiges Ziel dieses Modellsystem zu nutzen um die daran beteiligten Mechanismen aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen