Quantifizierung multivalenter Wechselwirkungen und massive Parallelisierung kraftspektroskopischer Messungen mittels Mikrofluidik am Beispiel von Virus-Rezeptor-Wechselwirkungen

• Antragsteller: Dr. Stephan Block
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 364654521

Multivalente Wechselwirkungen werden in einer Vielzahl biologischer Prozesse beobachtet (bspw. der Anbindung von Viren an Wirtszellen). Ein quantitatives Verständnis derartiger Prozesse erfordert die Möglichkeit, einzelne multivalente Wechselwirkungen zu quantifizieren, was ein bis dato ungelöstes Problem ist. Um dies zu adressieren, haben wir während der bisherigen Förderung zwei Methoden entwickelt, die Mikrofluidik und Totalreflexionsmikroskopie (engl. total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy) einsetzen und es ermöglichen, schwache und multivalente Wechselwirkungen mit Einzelmolekülauflösung und hohem Datendurchsatz zu vermessen. Wir konnten zeigen, dass die Mobilität membrangebundener Viren ein Maß für deren Valenz darstellt (d.h. der Anzahl der Einzelbindungen, die das Virus ausgebildet hat). Dies hat uns ermöglicht, wichtige Bindeparameter wie die Virusanbinderate, die (qualitative) Verteilung der Virusvalenz sowie die Ablöserate von Viren als Funktion der Valenz zu ermitteln.Obwohl dies fundamentale Einblicke in die Eigenschaften von Virus-Membran-Wechselwirkungen ermöglichte, war eine quantitative Messung der Valenz bisher nicht erfolgreich. Dies ist eine Folge eines Mangels an experimentellen Daten zum Einfluss der Valenz auf die Mobilität von Partikeln, die an eine substratunterstützte Lipiddoppelschicht (engl. supported lipid bilayer, SLB) angebunden sind. Obwohl dieser Aspekt in membranhydrodynamischen Theorien sehr gut adressiert wurde, fehlt bislang deren experimentelle Bestätigung. In der finalen Förderperiode werden wir daher erst seit kurzem verfügbare Methoden und Systeme einsetzen, um den Zusammenhang von Valenz und Mobilität bei SLB-gebunden Nanopartikeln (Proteinen und Viren) durch optimierte Mobilitätsstudien quantitativ zu bestimmen. Mikrofluidik, TIRF-basierte Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie und Einzelpartikelverfolgung werden verwendet, um die Bewegung der B-Untereinheit des Choleratoxins, von virusartigen Partikeln des Polyomavirus SV40 sowie von Influenza A Viren in Ab- und Anwesenheit von Scherkräften zu vermessen. Wir werden Rezeptoren und Nanopartikel mit verschiedenen Farbstoffen markieren, so dass sowohl die Valenz (durch schrittweises Bleaching) als auch die Mobilität einzelner SLB-gebundener Nanopartikel simultan vermessen werden können. Ferner kann zusätzlich eine hydrodynamisch erzeugte Scherkraft an die Nanopartikel angelegt werden, was das sequentielle Ablösen einzelner Rezeptoren und somit die Ermittlung der Rezeptorablöserate als Funktion der Valenz ermöglichen wird.Beide Ansätze werden neue Informationen zur Hydrodynamik von substratunterstützten Membranen sowie eine Quantifizierung der Valenz multivalenter Wechselwirkungen ermöglichen. Obwohl wir dies in erster Linie anhand von Viren demonstrieren, können die entwickelten Methoden prinzipiell auch auf andere Formen multivalenter Wechselwirkungen an Grenzflächen (bspw. auf Krankheitserreger im Allgemeinen) angewendet werden.

• DFG-Verfahren: Emmy Noether-Nachwuchsgruppen