Characterization of molecular mechanisms controlling phagocytosis of precancerous hepatocytes by macrophages and phagocytosis escape of hepatocellular carcinomas
Final Report Abstract
Ein tetrazyklin-induzierbares lentivirales System zur Genexpression wurde etabliert, um mehr als zehn unterschiedliche, immunogene Transgene in einem subkutanen Tumormodell für kolorektale Karzinome zu testen. Die Liste der klonierten Transgene umfasste unter anderem konstitutiv aktives STING, Chemokine, Interleukine und shRNA Sequenzen gegen immunsuppressive Zielgene. Die Expression dieser Transgene und ihre Funktion wurden in vitro validiert und ein Teil von ihnen in verschiedene Zelllinien mit hepatischem und kolorektalem Ursprung kloniert, um die in vivo Funktion im subkutanen Tumormodell zu testen. Wie dargelegt werden konnte, eignet sich dieses Tumormodell einerseits ideal zur Testung von Transgenen im Kontext verschiedener Organsystem (in diesem Fall Leber, Pankres und Kolon), andererseits aber auch durch die simultane Verwendung von Zelllinien mit unterschiedlichen Transgenen zur synchronen Testung unterschiedlicher Konstrukte. Dabei zeigte sich zum einen, dass dasselbe Konstrukt in verschiedenen Zelllinien unterschiedliche Veränderungen der Immunzell-Komposition hervorrief. Zum anderen zeigten die Versuche auch, dass die Veränderungen der Immunantwort, die eine Kombination aus zwei Transgenen hervorrief, sich erheblich von den Immunantworten der Einzelkonstrukte unterschied. Um das Modell, das ursprünglich lediglich die Analyse von intratumoralen Immunzellpopulationen mittels FACS Analyse vorsah, weiter zu verbessern, wurde eine Multiplex Immunhistochemie mit bis zu sieben simultanen immunhistochemischen Markern etabliert, die zusätzlich die Analyse der Lokalisation und Interaktion der Immunzellen in den Tumoren ermöglichte. Diese Analysen bestätigten, dass die Kombination verschiedener Transgene kein simpler additiver Effekt der Einzel-Transgene war, sondern ein komplexer Prozess, dessen Wirkung auf das Immunsystem erst durch das von uns entwickelte Tumormodell evaluiert werden konnte. Weitere Untersuchungen zur Interaktion verschiedener Immunzellpopulationen im Tumor laufen aktuell und werden in die finale Publikation einfließen. Das etablierte Modell eröffnet die Möglichkeit einer präklinischen Testung von Mono- und Kombinations-Immuntherapien anstelle der sonst üblichen empirischen Testung in klinischen Studien, bei der hohe Kosten und oftmals negative Studienergebnisse entstehen. Die Verwendung einer induzierbaren Genexpression ermöglicht die detaillierte Analyse vor, während und nach der Genexpression und erlaubt selbst die Untersuchung von Transgenen, deren Immunogenität bei konstitutiver Aktivierung so stark ist, dass in vivo keine Tumore entstehen. Unser Tumormodell stellt somit eine wichtige Ressource dar, die zukünftig genutzt werden kann, um bessere und effizientere Immuntherapien zu entwickeln.
