Biochemische und strukturelle Analyse ungewöhnlicher Docking-Domänen in nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS)

• Antragsteller: Professor Dr. Henning D. Mootz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 368772725

Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind die Proteintemplate und Katalysatoren der Biosynthese von kleinen, bioaktiven Peptiden wie z.B. Daptomycin und Cyclosporin, die überragende Bedeutung als Pharmazeutika haben. NRPS sind modular aufgebaut und enthalten innerhalb eines Moduls die für den Einbau einer Aminosäure wichtigen katalytischen Domänen. Bakterielle NRPS bestehen meist aus mehreren Polypeptidketten, über die die Module verteilt sind. Die intermolekularen Interaktionen sind essentiell für das korrekte Zusammenspiel der Polypeptidketten und werden durch verschiedene Typen von kleinen Docking-Domänen vermittelt. In Fokus dieses Projektes steht die Protein-Protein-Wechselwirkung an der Interaktionsfläche zwischen den Epimerisierungs- und Kondensationsdomänen (E- und C-Domänen), die durch den sogenannten COM-Domänentyp erreicht wird (communication-mediating). Die Struktur und die Spezifitäts-bestimmenden Aminosäuren in diesem Bereich sind nicht bzw. unzureichend verstanden. Durch ihre zumindest partielle Einbettung in die benachbarten Domänen sind die Interaktionsbereiche nicht isoliert zu studieren. In bisherigen Arbeiten konnten wir durch Studien mit genetisch kodierten Photo-Quervernetzern räumliche Beziehungen identifizieren, die ein Helix-Hand-Modell der Interaktion unterstützen. Eine genauere molekulare Kenntnis der Struktur steht jedoch noch aus. Gegen Ende der letzten Förderperiode gelang uns die erstmalige Kristallisation einer COM-Domäne, deren mittlerweile gelöste Struktur die Basis für diesen Antrag bildet. Im Vordergrund dieses Projektes stehen die strukturbasierte Aufklärung der spezifitätsvermittelnden Aminosäuren, ihre gezielte Mutation zur rationalen Reprogrammierung von COM-Domänen sowie die Frage nach der möglichen architektonischen Rolle der COM-Domänen. Da COM-Domänen ebenfalls in fusionierter Form (cis-COM) zwischen internen E- und C-Domänen anzutreffen sind postulieren wir erstmals eine Bedeutung für das korrekte räumliche Zusammenspiel der katalytischen Domänen. Wir werden testen, ob gespaltene COM-Domänen (trans-COM) aus cis-COM-Domänen gewonnen werden können und damit eine denkbare evolutionäre Entwicklung nachzeichnen. Ein detailliertes strukturelles und biochemisches Verständnis der COM-Domänen wird diese ungewöhnlichen Docking-Domänen erstmals ausreichend charakterisieren. Die Entschlüsselung der trans-COM-Interaktionen wird einen sehr wichtigen Beitrag zur kombinatorischen Reprogrammierung von NRPS darstellen, insbesondere da in den COM-Domänen der Zugang zu den E-Domänen liegt, die mit ihren D-Aminosäuren die strukturellen Eigenschaften der bioaktiven Peptidprodukte maßgeblich prägen. Zur Untersuchung der COM-Modellsysteme anhand von gereinigten, rekombinanten Proteinen werden neben der Proteinkristallographie zahlreiche biochemische und biophysikalische Methoden sowie modernes Carbene-Footprinting zum Einsatz kommen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen