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One-pot shotgun Zellbiologie

Fachliche Zuordnung Biophysik
Bild- und Sprachverarbeitung, Computergraphik und Visualisierung, Human Computer Interaction, Ubiquitous und Wearable Computing
Bioinformatik und Theoretische Biologie
Biomedizinische Systemtechnik
Optik, Quantenoptik und Physik der Atome, Moleküle und Plasmen
Zellbiologie
Förderung Förderung von 2017 bis 2021
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 371923335
 
Erstellungsjahr 2022

Zusammenfassung der Projektergebnisse

In der Zellbiologie, sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der biomedizinischen Forschung, werden häufig sogenannte Hochdurchsatzexperimente gemacht, um systematisch die Funktion von zellulären Komponenten, insbesondere von Proteinen, zu studieren, oder um den zellulären molekularen Wirkmechanismus von Substanzen zu analysieren. Diese Experimente sind sehr aufwändig, weil dabei sehr viele verschiedene biologische Proben bearbeitet werden müssen, um z.B. alle 6000 bis 30000 Proteine einer typischen eukaryotischen Zelle zu untersuchen. In diesem Projekt haben wir Methoden entwickelt, um im Falle von sogenannten Lebend-Zell Experimenten, bei denen Proteine mit fluoreszierenden Proteinen (sog. Reportergenen) markiert werden, die Probenzahl massiv zu reduzieren, weil man jetzt nicht mehr nur ein Protein per Probe untersucht, sondern gleichzeitig in Probenmischungen alle Proteine untersuchen kann. Das Problem das gelöst wurde, bestand darin, wie man gleichzeitig in nur 1 Schritt und einem Reaktionsgefäss alle Proteincodierenden Gene mit einem fluoreszierenden Reportergen markieren kann, so dass man dann eine Mischung von Zellen kriegt, die in ihrer Gesamtheit alle Protein- Lokalisierungsinformation beinhaltet. Dazu haben wir mittels einer neuen CRISPR/Cas Strategie sogenannte Selbst-Integrierende Kassetten (Self-Integrating Cassettes) entwickelt, die man mittels Oligo-Array-synthetisierten Oligos so programmieren kann, dass sie sich an alle gewünschten Protein-Gene im Genom anhängen, jeweils ein anderes Gen pro Zelle in der Mischung. Wir haben gezeigt, dass das hervorragend mit Hefezellen funktioniert, und in einer weiteren Arbeit konnten wir demonstrieren, dass es auch mit tierischen und menschlichen Zellen funktioniert. Damit man mit solchen Mischungen optimal arbeiten kann, haben wir Methoden entwickelt wie man solche Mischungen effizient charakterisieren kann. Erstens haben wir eine DNA Sequenziermethode entwickelt, mit Hilfe derer man die Insertionsstellen der Reportergene im Genom genau bestimmen kann, für jede Zelle in der Mischung. Mit dieser Methode kann man auch genau messen, wie die Verteilung der unterschiedlichen Zellen mit bestimmten Insertionen ist. Das ist z.B. wichtig, wenn man mit diesen Mischungen ein Experiment durchführt, man dabei die Mischungen dann in verschiedene Unter-Mischungen aufteilt, z.B. durch Zellsortierung, und man dann wissen möchte, wie sich die Zusammensetzung verändert hat. Damit man solche Sortierexperimente optimal durchführen kann, benötigt es weiterhin eine neuartige Art der Analyse von mikroskopischen Bildern, weil die übliche Fluoreszenzmikroskopie vorwiegend homogene Zellpopulationen analysiert, während wir es hier mit komplexen Daten zu tun haben, die für jede Zelle ganz anders aussehen können. Dementsprechend wurden Deep Learning Algorithmen basierend auf künstlichen Neuronalen Netzen entwickelt, um die charakteristische räumliche Verteilung von Fluorenszenzmustern von anderen nicht relevanten Merkmalen zu trennen. Hierzu haben wir Bildsyntheseverfahren implementiert, die eine Repräsentation der typischen räumlichen Form von visuellen Mustern erlernen und diese dabei von anderen Einflussfaktoren separieren. Weiterhin war es unser Ziel, nicht auf aufwendige manuelle Annotationen angewiesen zu sein, um effizient eine große Anzahl unterschiedlicher Muster erfassen zu können. Dies wurde durch ein unüberwachtes Lernverfahren erreicht, das nur von Bilddaten lernt, ohne Annotationen zu benötigen. Um die automatische Gruppierung von Zellpopulationen zu ermöglichen, haben wir darüber hinaus Algorithmen entwickelt, die Ähnlichkeiten zwischen Bildern messen können. Schließlich haben wir Methoden entwickelt, die die von Neuronalen Netzen gelernten Repräsentationen für einen Nutzer verständlich und damit für die Nutzung in der biologischen Anwendung verlässlich machen. Als letzten Punkt des Projektes hatten wir versucht ein Mikroskop zu entwickeln, welches die theoretischen Bildanalyseverfahren integriert und mittels Mikrofluidik Zellen nach dem Lokalisierungssignal eines Reportermarkierten Proteins sortiert. Während der Laufzeit des Projektes konnten wir einige wichtige technische Probleme lösen und in einer ersten Publikation veröffentlichen, aber wir hatten dabei die technischen Herausforderungen unterschätzt und konnten das Ziel eines funktionierenden Gerätes (noch) nicht erreichen. Eine Publikation dieses Projektes führte zu einem Interview mit Knop und Constantinou für einen Themenartikel zu bildgebender Zytometrie in der in Deutschland sehr weitverbreiteten Zeitschrift „Laborjournal“ (https://laborjournal.de/rubric/methoden/methoden/v215.php). Das Erlernen von Bilddarstellungen, bei denen die verschiedenen Merkmale wie Form und Aussehen entflochten werden, ist ein wichtiger Schritt zur Verbesserung der Kolokalisierungsanalyse. Wir konnten außerdem zeigen, dass diese Entflechtung in den Biowissenschaften weithin anwendbar ist. Darüber hinaus haben wir uns mit den gesellschaftlichen Auswirkungen der Anwendung der entwickelten Entflechtung befasst, die in einem fastcompany-Artikel und auch in der Zeitschrift P.M. beschrieben werden.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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