Funktionen der Protein Kinase D2 während der Aktin-vermittelten Vesikelabschnürung am Trans-Golgi-Netzwerk (TGN).

• Antragsteller: Dr. Tim Eiseler, seit 1/2019
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 380319649

Die konstitutive Sekretion von Proteinen ist essentiell für die Kommunikation von Zellen untereinander, sowohl unter normalen Bedingungen, als auch bei Krankheiten, wie Krebs. Entsprechende Transport-Vesikel werden dabei durch Zyklen der Vesikel-Ausbildung und Abschnürung am Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) erzeugt. ADP-ribosylation-factor (ARF) GTPasen und Kinasen der Protein Kinase D Familie (PKD) spielen hierbei eine zentrale Rolle. Unsere nicht publizierten Daten zeigen nun außerdem, dass PKD2 an der Regulation der Aktinpolymerisation am TGN beteiligt ist, welche die finale Abschnürung von Vesikeln steuert. Des Weiteren phosphoryliert PKD2 ihr Substrat Cortactin am S298 und inhibiert so die Aktinpolymerisation. Unsere Daten zeigen nun, das Cdc42 PKD2 am TGN inaktiviert und so die synergistische Cortactin-N-WASP-regulierte Aktinpolymerisation am TGN antreibt. Zusammen mit oligomerisiertem Dynamin2 am Vesikel-Hals soll dabei die finale Abschnürung von Vesikeln unterstützt werden. Interessanterweise, konnten wir Dynamin2 auch als neues PKD Substrat identifizieren. Ziel des Antrages ist es daher nun zu erforschen, wie die Aktinpolymerisation und das Abschnüren von Vesikeln durch PKD2 koordiniert und reguliert wird. Es sollen die folgen Ziele erforscht werden. Ziel1: Kontrolle der PKD2 Aktivität während der verschiedenen Phasen der Vesikel-Abschnürung. Dabei werden wir eine mögliche Funktion des CDC42-GTPase-Aktivierungsproteins ARHGAP21 bei der Regulation der PKD2 Aktivität und deren Kontrolle durch den ARF1-Aktivitätsstatus näher untersuchen. Wir werden zudem erforschen, wie die Wechselwirkung zwischen ARF1 und Rho-GTPasen am TGN auf molekularer Ebene von statten geht. Ziel2: Regulation der Aktinpolymerisation bei der Vesikel-Abschnürung am TGN durch PKD2, Cortactin und Dynamin. Wir wollen aufklären, wie N-WASP, der Arp2/3-Komplex, Cortactin und die GTPase Dynamin2 die Vesikel-Abtrennung durch koordinierte Aktinpolymerisation regulieren. Insbesondere soll auch untersucht werden, wie die Phosphorylierung von Cortactin durch PKD2 die Steuerung der Vesikel-Abtrennung kontrolliert. Außerdem wollen wir aufklären, wie PKD2 und das Substrat Dynamin2 bei der Koordination der Vesikel-Abschnürung mit der gerichteten Aktinpolymerisation am Vesikel-Hals zusammenwirken. Ziel3: In vitro Rekonstitution PKD2-vermittelter Vesikel-Abtrennung. Mittels Liposomen und großer unilamellar Vesikel (GUVs) werden wir definierte Aspekte der Vesikel-Biogenese in vitro darstellen. Phospho-Mutanten von Cortactin und Dynamin2 sollen dabei z.B. zusammen mit dem Bar-Domänen Protein Amphiyphysin die Mikrovesikulation vom GUVs modulieren. Außerdem wollen wir den Einfluss von gekrümmten Membranen und die Aktivierung von GTPasen bei diesen Prozessen näher erforschen. Mit dem erfolgreichen Abschluss der Arbeiten hoffen wir die verschieden Funktion von PKD2 während der Vesikel-Abschnürung am TGN näher aufklären zu können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Ehemalige Antragstellerin: Professorin Julia von Blume, Ph.D., bis 1/2019