Etablierung von Doxyzyklin-regulierbaren Mauslinien zur reversiblen Expression von Transgenen in B-lymphoiden Zellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Möglichkeit, ein Gen bezüglich Beginn, Dauer und Menge seiner Expression sowohl in der Zellkultur als auch im transgenen Organismus kontrollieren zu können, hat wesentlich zur Aufklärung von Proteinfunktionen in Zellphysiologie und -differenzierung, Entwicklung oder Pathogenese beigetragen. In transgenen Organismen werden hauptsächlich zwei heterologe Regulationssysteme eingesetzt, das Tet- und das Cre/lox-System. Das Cre/lox-System kontrolliert die Expression eines Zielgens durch DNA-Rekombinationsereignisse. Das Tet-System hingegen besteht aus einem Minimalpromotor und einem von Tetrazyklin-Derivaten gesteuerten Transaktivator, bildet also eine künstliche Transkriptionseinheit. Die reversible Bindung des Transaktivators an den Minimalpromotor erlaubt es, die Expression des nachgeschalteten Zielgens durch Zugabe und Entfernung des Effektors mehrfach anund wieder auszuschalten. Gleichzeitig kann durch die gegebene Menge an Effektor auch die gebildete Menge des Zielproteins verändert werden. Unser Ziel war es, Regulationssysteme zu entwickeln, die die kontrollierte Expression von Zielgenen während der Stadien der B-Zellentwicklung ermöglichen. Dazu wurde ein Knock-In des reversen Transaktivators rtTA2S-M2 in den B29-Lokus von V6.5 und R1 ES-Zellen durchgeführt und neun positiv rekombinierte Klone erhalten. Diese wurden in Blastozysten injiziert und eine chimäre Maus erhalten, die das Konstrukt in der Keimbahn trug. Nach Rückkreuzung gegen C57BL/6-Mäuse und Kreuzung mit einer Reporter-Maus, die ein EGFP-Gen unter Kontrolle eines Tetrazyklin-abhängigen Promotors trug, konnte die Doxyzyklin-abhängige Expression von GFP in Pre- und Pro-B-Zellen gezeigt werden. In späteren B-Zell-Entwicklungsstadien war keine Reportergenexpression nachweisbar. Nach Kreuzung mit einer Maus, die eine µ-schwere Kette unter Kontrolle eines Tetrazyklinabhängigen Promotors trägt, konnte keine Doxyzyklin-abhängige Expression der schweren Kette gezeigt werden. Desweiteren wurde ein Knock-In-Vektor für den ROSA26-Lokus hergestellt. Hier wurde ein stringent regulierter Tetrazyklin-abhängiger Promotor mit einem EGFP-Reportergen hinter einer transkriptionellen Stop-Kassette integriert, um einen leicht zugänglichen Integrationsort für zu regulierende Zielgene zu charakterisieren. BALB/c ES-Zellen wurde mit dem Vektor transfiziert und 400 resistente Klone erhalten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
(2010). Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J. Gene Med. 12, 501–515
Danke C., Grünz X., Wittmann J., Schmidt A., Agha-Mohammadi S., Kutsch O., Jäck H.-M., Hillen W., Berens C.
