CRB1 in der humanen Retina in vitro: funktionelle, pathomechanistische und entwicklungsbiologische Untersuchungen unter Zuhilfenahme von retinalen Organoiden aus humanen induziert pluripotenten Stammzellen

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Liebau
• Fachliche Zuordnung: Augenheilkunde ; Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen ; Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 382162936

Die vorliegende Studie wurde entworfen, um einen tieferen, mechanistischen Einblick in die Funktion des CRB1 Proteins während der Entwicklung der humanen Retina zu gewinnen, sowie um insbesondere Rückschlüsse über dessen Rolle in zellulären Pathomechanismen vererbter Erkrankungen der Retina ziehen zu können. Für diesen Forschungsansatz soll das Modell der humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPS Zellen) und daraus generierten 3-dimensionalen Retina-Organoiden angewandt werden. In diesem Zusammenhang planen wir die (1) Differenzierung der Retina-Organoide aus patientenspezifischer hiPS Zellen mit diagnostizierten homozygoten Mutationen im CRB1-Gen, sowie von Kontroll-hiPS Zellen, (2) Untersuchung der genauen Rolle von CRB1 in der Entwicklung und Reifung retinaler Zellen. In diesem Zusammenhang werden wir einerseits die Expressionsmuster der CRB-Familie auf Transkript- und Proteinebene, mit Fokus auf CRB1, während der in vitro Entwicklung untersuchen, zum anderen patientenspezifische Abweichungen von Expression und Lokalisation darstellen. Weiterhin wollen wir funktionelle Aspekte der kontroll- und patienten-spezifischen Retina, sowie strukturelle Veränderungen, z.B. der äußeren Grenzmembran, an deren Bildung CRB1 beteiligt ist, aufdecken. Das uns zur Verfügung stehende Zeitfenster der humanen Retina-Entwicklung beläuft sich in vitro von den frühen Zeitpunkten der retinalen Vorläuferzellen im sich ausdifferenzierenden Neuro-Ektoderm über die Entwicklung der einzelnen Retina-Schichten bis hin zu funktionellen, licht-sensitiven Photorezeptoren. Die Bestimmung und Untersuchung der unterschiedlichen Reifungsstadien erfolgt dabei in fixierten Zellen durch Immunzytochemie und FACS bekannter Marker, sowie in lebenden Zellen unter Zuhilfenahme von live-cell FACS-analysen, sowie Fluorophor-Expression durch Promotor-Reporter Konstrukten, die bereits stabil in das Genom von iPS Zellen eingebrachte wurden. In einem weiteren Punkt wollen wir Signalwege und zelluläre Mechanismen aufdecken, an denen CRB1 beteiligt ist und eventuell mit dem Krankheitsmechanismus in Verbindung stehen. Ausblick: Diese Mechanismen und Signalwege werden anschließend gezielt untersucht sowie pharmakologisch moduliert, um mögliche Ansätze für einen therapeutischen Ansatz gegen die Degeneration der Retina im Menschen unter CRB1 Mutationen zu erreichen. Zusammengenommen ist es möglich, auf der einen Seite die Rolle von CRB1 in der humanen retinalen Entwicklung zu spezifizieren, auf der anderen Seite kann die Entwicklung der humanen Retina-Organoide unter dem Einfluss krankheitsspezifischer Genmutationen erforscht werden. Diese Charakterisierung könnte hilfreich sein, um die Rolle von CRB1 als Krankheitsfaktor für die Entstehung und Progression der retinalen Erkrankung besser zu verstehen

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen