Struktur des Inhibitor-gebundenen plasmodialen Laktattransporters, PfFNT, durch Kryo-EM

• Antragsteller: Professor Dr. Eric Beitz
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 387280051

Im vorangegangenen Projekt konnten wir neue wirkstoffartige Inhibitoren des lebensnotwendigen Laktattransporters, PfFNT, von Malariaerregern, Plasmodium falciparum, generieren. Den ursprünglichen PfFNT-Inhibitor entdeckten wir durch Screening einer Antimalaria-Substanzbibliothek; jedoch löste dieses Molekül bei subletaler Dosierung Resistenz in kultivierten Parasiten aus. The Resistenz basiert auf einer Mutation im PfFNT-Gen, das zum Austausch von Glycin107 zu Serin führt, PfFNT G107S. Das Serin verringert die Inhibitor-Affinität um 2 Größenordnungen wohl aufgrund einer Verengung der Bindetasche. Wir synthetisierten fünf Reihen an Verbindungen zur Resistenzumgehung, und erreichten diese mit der neuesten Inhibitor-Generation. In den ersten Verbindungen ersetzten wir ein Benzyl durch kleinere Reste, wie eine aliphatische Kette oder 5-gliedrige Heterozyklen, oder setzten einen Linker vor das Benzyl. Die meisten Verbindungen waren voll aktiv an PfFNT aber erhöhten die Affinität zum resistenten PfFNT G107S nicht. An diesem Punkt planten wir, die Serin-Seitenkette nicht einfach zu umgehen, sondern vielmehr durch die Ausbildung einer zusätzlichen Wasser-stoffbrücke zusätzlich auszunutzen. Hierzu verwendeten wir wieder 6-gliedrige, nun stickstoff-haltige Ringe als H-Brücken-Akzeptoren. Tatsächlich hemmten solche Substanzen erstmalig den resistenten Transporter ähnlich gut wie den Wildtyp. Von Bedeutung ist, dass die Parasiten auch bei einer sublethalen Dosierung nicht ausweichen und neue Resistenzen entwickeln konnten. Die neuen Inhibitoren sind von einem EU und einem neuen US-Patent abgedeckt.Mit diesem Fortsetzungsantrag wollen wir die hochaufgelöste Struktur des Inhibitor-gebundenen PfFNT ermitteln und die Funktion zweier lipophiler Engstellen im Transportpfad des PfFNT aufklären; in diesem Bereich binden unsere Inhibitoren. Wir haben Kontakt zu Peter Rosenthal, Crick Institut, London, etabliert, der uns Zugang zur Kryo-EM ermöglicht. Zudem haben wir Protokolle zur Präparation von PfFNT-Proben von hoher Qualität erstellt und durch negative stain Elektronenmikroskopie bestätigt, ebenso erhielten wir erste Kryo-EM-Bilder des PfFNT.Dieser Antrag teilt sich daher in drei Hauptziele:1. Wir werden PfFNT zellfrei und, falls nötig, Hefe-basiert produzieren, geeignete solubilisierende Detergenzien identifizieren, die Proteinqualität durch Spektroskopie, funktionelle Rekonsti-tution und negative-stain EM prüfen, um sie bei Eignung zur Kryo-EM zu senden.2. Wir werden PfFNT alternativ in Nanodisks mit natürlicher Lipidumgebung integrieren.3. Wir werden PfFNT mit Engstellen-erweiternden Mutationen biophysikalisch charakterisieren.Wir erwarten dabei Einblicke auf zwei Ebenen: i. Angewandte Ebene zur Antimalaria-Wirkstoff-Entwicklung durch Etablierung des Bindemodus, ii. Grundlagenebene zum Transportmecha-nismus, i.e. Visualisierung der Seitenkettenbewegung bei Inhibitorbindung in der FNT-Engstelle.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Kooperationspartner: Dr. Peter Rosenthal