Identifizierung und Charakterisierung kleiner Proteine im Lebensmittelkeim Campylobacter jejuni

• Antragstellerin: Professorin Dr. Cynthia Mira Sharma
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 388129568

Die Entschlüsselung des Genrepertoires von bakteriellen Pathogenen ist essentiell, um ihre Überlebens- und Infektionsstrategien zu verstehen. Kleine Proteine von ≤ 70aa, die von kleinen ORFs (sORFs) kodiert werden, sind eine neue Klasse von Genprodukten, die verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Virulenz, beeinflussen können. In diesem Projekt wollen wir kleine Proteine im weitverbreiteten Lebensmittelkeim Campylobacter jejuni erforschen, über die bislang nur wenig bekannt ist. In der 1. Phase des SPP2002 haben wir in C. jejuni eine Kombination aus globaler Translatomanalyse mittels Ribosome Profiling (Ribo-seq) und bioinformatorischen sORF-Vorhersagen durchgeführt, und darüber zahlreiche sORF-Kandidaten entdeckt. Dies wurde mit Proteinmassenspektrometrie und einer neu etablierten Methode zur Kartierung von Translationsinitiationsstellen (TIS) verknüpft. Mittels Epitopmarkierung und Western Blot haben wir die Expression von mehr als 45 C. jejuni sORFs validiert. In der 2. Periode wollen wir nun bioinformatische Vorhersagen aus Ribo-TIS-Daten einsetzen, um die genomweite Annotation von sORFs zu verfeinern, insbesondere von sORFs, die innerhalb größerer Genen liegen. Zudem werden wir eine von uns neu entwickelte Methode zur Kartierung von Terminationsstellen (TTS) mit einem auf kleine Proteine zugeschnittenen Proteomik-Datensatz kombinieren, um unser Set an kleinen Proteinen aus C. jejuni weiter zu verfeinern. Ein Fokus wird nun auf der Untersuchung der Funktionen von ausgewählten kleinen Proteinen mit einer möglichen Rolle in Infektionen/Motilität liegen, die wir mittels Konservierungsanalysen und laboreigenen Datensätzen (RNA-seq unterschiedlicher Wachstumsphasen, Infektions-Tn-seq und -Dual RNA-seq) ausgewählt haben. Beispielsweise konnten wir bereits zeigen, dass Deletionsmutanten von Mot2 (57aa) nicht motil sind und paralysierte Flagellen haben, da sie keine basalen Disk-Strukturen aufbauen können, die normalerweise ein Gerüst für den Flagellenmotor bilden. Um die hier zugrundeliegenden Mechanismen zu identifizieren werden wir z.B. zielgerichtete Mutagenese einsetzen sowie potentielle Mot2-Interaktionspartner mittels Koimmunopräzipitation identifizieren. Weitere Kandidaten sind potenzielle Homologe von kleinen Proteinen aus terminalen Oxidase-Komplexen (CydY/H) und sORFs mit Infektionsphänotypen oder in Verbindung zu Flagellengenen. Die Untersuchung kleiner Proteine mittels Markierungen ist oftmals technisch schwierig. Daher wollen wir die Thermal-Proteome-Profiling (TPP)-Methode anwenden, um anhand von veränderten thermischen Profilen von Zielproteinen nach Deletion eines sORFs Einblicke in die Interaktionspartner oder Signalwege kleiner Proteine zu gewinnen. Neben der Erweiterung und Verfeinerung der Genomkarte von C. jejuni wird dieses Projekt neue Funktionen kleiner Proteine aufdecken und Ansätze entwickeln, die auch zur Erforschung kleiner Proteine und deren Funktionen in anderen Prokaryonten verwendet werden können.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2002: Kleine Proteine in Prokaryoten, eine unbekannte Welt