Lysosomale Gentranskription und Proteinexpression

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Braulke; Dr. Dominic Winter
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323732846

Zahlreiche Proteine, die an der Biogenese von Lysosomen und an Autophagieprozessen beteiligt sind, unterliegen einer transkriptionellen Regulation, bei der der Transkriptionsfaktor EB (TFEB) und verschiedene Repressoren eine entscheidende Rolle spielen. Die transkriptionelle Aktivität von TFEB wird durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung mehrerer konservierter Serinreste bestimmt, die dessen Lokalisation an der Oberfläche der Lysosomen, im Cytoplasma oder im Zellkern steuern. In der ersten Förderperiode haben wir zahlreiche massenspektrometrische (MS) Methoden entwickelt, die die Detektion posttranslationaler Modifikationen (PTMs) von TFEB und die absolute Quantifizierung von 144 verifizierten lysosomalen Proteinen in jeder Art von murinen Proben ermöglichen. Mit diesen Ansätzen gelang die Identifizierung von 30 Phosphorylierungs- und 7 Acetylierungsstellen in TFEB, die in mehr als 30 Isoformen resultieren, die 2D elektrophoretisch aufgetrennt werden konnten. Der Austausch verschiedener Acetylierungsstellen hemmte vollständig die transkriptionelle Aktivität von TFEB, was hauptsächlich auf dessen Retention im Cytoplasma durch noch unbekannte Mechanismen zurückzuführen ist. In der 2. Förderperiode wollen wir analysieren, ob mutierte TFEB Acetylierungsstellen zu sekundären Veränderungen im Phosphorylierungsmuster führen. Außerdem möchten wir die PTMs einzelner isolierter TFEB Isoformen bestimmen, und untersuchen, wie sich die kombinierten, spezifischen Austausche dieser modifizierten Reste auf die subzelluläre Lokalisation, die transkriptionelle Aktivität und die Proteome von Lysosomen und deren Subpopulationen auswirken. Weiterhin planen wir, spezifische Interaktionspartner von acetyliertem TFEB mit Hilfe von Biotinylierung (proximity labelling), Ko-präzipitation und MS-basierten Methoden zu identifizieren, und deren Rolle bei der transkriptionellen Aktivierung lysosomaler Gene zu untersuchen. Außerdem werden wir TFEB- abhängige und unabhängige Mechanismen der Repression verschiedener lysosomaler Gene in Zellmodellen lysosomaler Erkrankungen untersuchen. Diese Ansätze werden uns ein tiefgehendes Verständnis der Interaktion repressorischer und aktivatorischer Mechanismen und der zugrundeliegenden Rolle von PTMs für die Autophagie und die Funktion von Lysosomen vermitteln.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 2625: Mechanismen der Lysosomalen Homöostase