Quantitative Bestimmung des Effekts der Transkriptionsfaktoren TFEB und TFE3 auf die Expression lysosomaler Proteine

• Antragsteller: Professor Dr. Volkmar Gieselmann; Dr. Dominic Winter
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323732846

Untersuchungen an lysosomalen Proteinen beschränken sich in der Regel auf ein einzelnes Protein oder fokussieren sich auf eine Gruppe repräsentativer Proteine, die sich gut in qPCR oder western blot Experimenten nachweisen lassen. Mit diesen gut etablierten Methoden ist es sehr schwierig alle momentan bekannten lysosomalen Proteine in einem Experiment zu untersuchen. Weiterhin ist es praktisch unmöglich deren absolute Menge, die Anzahl der Kopien pro Zelle, sowie die Stöchiometrie mit welcher diese Proteine am Lysosom vorliegen, zu bestimmen.Um dies zu untersuchen, haben wir synthetische Standardproteine entworfen, so genannte QConCats (Prat et. Al 2006), die erlauben 144 der momentan bekannten 153 lysosomalen Proteine in jeglichen Proben von murinen Zellen oder Organen absolut zu quantifizieren. QConCats sind artifizielle Proteine die aus proteolytischen Peptiden mehrerer zu quantifizierender Proteine bestehen. Die QConCats werden in stabile-Isotopen markiertem Medium exprimiert und zu den Proben hinzugegeben. Durch proteolytischen Verdau entstehen aus den QConCat Proteinen stabile-Isotopen markierten Peptide welche als interner Standard, für die Peptide die durch Proteolyse des endogenen Proteins generiert wurden, fungieren. Dies macht es möglich die Proteine absolut zu quantifizieren. Dafür kommen so genannte Triple Quadrupol Massenspektrometer zum Einsatz welche im Multiple Reaction Monitoring (MRM) Mode betrieben werden. Diese Messungen sind sehr robust, linear, reproduzierbar und erlauben es die untersuchten Peptide (und dadurch deren Proteine) in hochkomplexen Mischungen (z.B. Gesamt-Zelllysate oder Gewebelysate) ohne vorherige Anreicherung oder Fraktionierung der Probe zu quantifizieren.Wir haben 12 stabile-Isotopen markierte QConCats die jeweils repräsentative Peptide für 12 lysosomale Proteine enthalten generiert und analysiert. Dies erlaubt, 144 verifizierte lysosomale Proteine absolut zu quantifizieren. Wir nennen diese Standards Lysosomale QConCats (LysoQCCs). Das Projekt wird die Messparameter etablieren mit welchen diese LysoQCCs verwendet werden können um die absoluten Mengen lysosomaler Proteine in murinen Gesamtzell- oder Gewebelysaten zu bestimmen. Mit dieser Methode wird dann die Regulation der Proteinexpression der 144 bestätigten lysosomalen Proteinen durch den Transkriptionsfaktor EB (TFEB), der als Master Regulator lysosomaler Biogenese betrachtet wird, und dessen nahen Verwandten, TFE3 bestimmt. Umfangreiche posttranslationale Modifikationen (PTMs) von TFEB führen zu einer großen Vielfalt an TFEB Isoformen. Wir werden die PTMs der verschiedenen Isoformen analysieren und untersuchen inwiefern diese durch die ERK, mTORC1, GSK3ß und PKC Signaltransduktionswege beeinflusst werden. Durch LysoQCC-basierte Quantifizierung der lysosomalen Proteine in diesen Proben werden wir weiterhin untersuchen wie ausgesuchte PTMs das Spektrum lysosomaler Proteine, die durch TFEB kontrolliert werden, beeinflussen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 2625: Mechanismen der Lysosomalen Homöostase