Analyse der HOPS-abhängigen und -unabhängigen Wirkweise der VPS41 Funktion in der neuronalen Biogenese von Lysosomen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Judith Klumperman, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323732846

Der "homotypic and vacuole protein sorting" (HOPS) Komplex ist notwendig für die Fusion von Lysosomen mit Endosomen und Autophagosomen, einem kritischen Schritt bei der Degradation eingeschlossener Substrate. VPS41 ist eine Schlüsseluntereinheit des HOPS Komplexes, die über unbekannte, HOPS-unabhängige Mechanismen auch für den biosynthetischen Transport von reguliert sezernierten Proteinen und lysosomalen Membranproteinen wie LAMP1 und LAMP2 benötigt wird. Meine Gruppe ist daran interessiert, die regulierende Rolle von VPS41 in diesen unterschiedlichen Transportwegen zu verstehen. In der ersten Periode des Projektes untersuchten wir die Pathobiologie zweier Patienten mit VPS41 Mutationen (VPS41S285P und VPS41R662*), die beide einen schweren neurologischen Phänotyp zeigen. Wir fanden heraus, dass beide Mutationen die HOPS-Formation verhinderten, was zu einer verzögerten Endozytose, kleineren Lysosomen, einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors TFE3 und dadurch zu einer Hochregulierung der Autophagie-Maschinerie führt. Zudem dissoziierte der mTORC1-Komplex von den Lysosomen und Zellen konnten nicht mehr angemessen auf Nährstoffentzug reagieren, was eine Verbindung zwischen HOPS-Funktion und mTORC1-Aktivierung vermuten lässt. Interessanterweise konnte die regulierte Sekretion durch VPS41S285P wiederhergestellt werden, was darauf hinweist, dass die endozytotischen und biosynthetischen VPS41-Funktionen unterschiedlich reguliert sind, und zwar HOPS-abhängig und -unabhängig. Da VPS41-Mutationen einen neurologischen Phänotyp zur Folge haben, möchten wir in der zweiten Förderperiode die etablierten Protokolle und Methoden der ersten Förderperiode anwenden, um die HOPS-abhängige und -unabhängige Wirkweise von VPS41 in Neuronen zu verstehen. Für diesen Schritt werden wir in An- oder Abwesenheit von VSP41, seinen Interaktionspartnern oder anderen Genen von Interesse state-of-the-art "Correlative Live cell to Electron Microscopy" (CLEM) anwenden und Anzahl, Größe, Aktivität, Inhalt, Transport und Verteilung endo-lysosomaler Subpopulationen in bestimmten Domänen kultivierter hippocampaler Neurone ermitteln. Wir werden CLEM mit dem "Retention Using Selective Hooks" (RUSH) System kombinieren, um die kontrollierte Freisetzung und den Transport von GFP-markierten Proteinen wie LAMPs und synaptischen Vesikelproteinen zu beobachten. Durch Kombination von RUSH mit einem FKBP-Kinesin3-FRB System werden wir LAMP2.GFP-positive Vesikeln zur Plasmamembran segregieren und diese für molekulare Massenspektrometrie-Analysen sammeln. Zudem werden wir mit "proximity-based interactome" Studien und etablierten APEX-Konstrukten von VPS41 wildtypen und mutierten Formen Neuronen-spezifische VPS41-Interaktionspartner identifizieren. Hauptziel unseres Antrags ist es, den Mechanismus zu verstehen, mit welchem VPS41 biosynthetische und endozytotische Transportwege in Neuronen reguliert, und die Pathophysiologie von VPS41 Patienten zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 2625: Mechanismen der Lysosomalen Homöostase
• Internationaler Bezug: Niederlande