Charakterisierung von seltenen konformationellen Zuständen von Proteinen mit einer Kombination von Hochdruck-Röntgenkristallographie und Hochdruck-NMR-Spektroskopie. Anwendung auf das kleine G-Protein Ras, seine onkogenen Mutanten und seine Wirkstoffkomplexe.

• Antragsteller: Professor Dr. Hans Robert Kalbitzer
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 390275479

Hochdruck-NMR-Spektroskopie (HPNMR) stellt eine mächtige, noch in Entwicklung befindliche Methode dar, um seltene 'angeregte' konformationelle Zustände zu detektieren und zu charakterisieren. Diese Zustände spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion von Proteinen und der Proteinfaltung. HPNMR beschreibt die Thermodynamik dieser Zustände, liefert allerdings nur begrenzte strukturelle Informationen. Hochdruckkristallographie (HPMX) ist eine komplementäre neue Methode in der Proteinforschung, die prinzipiell hochaufgelöste räumliche Strukturen bei hohen Drücken liefern kann. Im Projekt konzentrieren wir uns auf das kleine G-Protein Ras (rat sarcoma), das Teil eines wichtigen, gut charakterisierten Signaltransduktionssystem ist (onkogene Ras-Mutationen werden in > 30 % aller menschlichen Tumoren gefunden). Es dient einerseits als gut charakterisiertes Modelsystem für die methodische Entwicklungen im vorgeschlagenen Projekt, andererseits sind neue thermodynamische und strukturelle Erkenntnisse potentiell von großer medizinischer Bedeutung, da sie bei der Entwicklung von allosterischen Rasinhibitoren helfen können. Mit Hilfe der HPNMR im Komplex von Ras mit dem GTP-Analog GppNHp in Lösung konnten wir vier verschiedene Zustände 1(0), 1(T), 2(T) und 3(T) thermodynamisch charakterisieren, die bei Normaldruck koexistieren. Mit kleinen Molekülen, die präferentiell an Zustand 1(T) binden, kann man allosterisch die Effektorwechselwirkung hemmen und damit prinzipiell die proliferierende Wirkung von onkogenen Ras-Mutanten aufheben. Die Hauptziele des Projekts sind, (1) eine genaue quantitative Analyse der seltenen konformationellen Zustände von H- und K-Ras und ihrer onkogenen Mutanten in GDP- und GppNHp-Komplexen mit Hilfe der HPNMR, unterstützt durch alternative NMR-Methoden wie CEST und Relaxationsdispersion, (2) der Nachweis, dass mit HPMX die Konformere mit höherer freier Energie bei bestimmten Drücken im Ras-Einkristall stabilisiert werden können, die in der Lösung mit HPNMR identifiziert wurden, (3) die Korrelation der beobachteten Druckantwort der NMR-Parameter mit Strukturänderungen in der HPMX und (4) der Nachweis, dass prinzipiell die HPMX-Strukturen für das Design spezifischer allosterischer Inhibitoren nutzbar sind werden. Zum Vergleich der Einkristall- und Lösungsstrukturen werden von den Röntgenstrukturen bei verschiedenen Drücken NOESY-Spektren populationsgewichtet rückgerechnet und mit den experimentellen NOESY-Spektren in Lösung im Detail verglichen. Wie die Vorarbeiten zeigen stellt Hochdrucksoaking mit kleinen zustandsspezifischen Molekülen, potentiell eine neue Methode dar, um seltene konformationelle Zustände der Kristallographie zugänglich zu machen. Die Dynamik von verschiedenen Zuständen unter Druck soll mit 2D NMR-Drucksprungexperimenten mit der von uns entwickelten Apparatur untersucht werden. Diese Untersuchung wird dann durch Relaxationsdispersions- und CEST-Experimente bei verschiedenen Drücken komplementiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen