Single mRNA interactome capture bei Arabidopsis thaliana

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dorothee Staiger
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 391749644

Höhere Pflanzen besitzen einen endogenen Zeitmesser, die circadiane Uhr, um physiologische Prozesse wie die Photosynthese, Wachstum oder Reaktionen auf Umwelteinflüsse optimal an den Tag-Nacht-Wechsel anzupassen. Die Bedeutung eines solchen Zeitmessers zeigt sich in der erhöhten Fitness von Pflanzen, die eine funktionierende innere Uhr besitzen. Grundlage für physiologische Rhythmen sind periodische Veränderungen im Transkriptom. Die rhythmische Transkription galt lange als Triebfeder für die circadiane Oszillation von mRNAs. Heute weiß man, dass die Regulation auf RNA-Ebene essentiell ist, damit Transkripte mit einer hohen Amplitude im 24-h Rhythmus oszillieren. mRNAs sind stets mit spezifischen RNA-Bindeproteinen assoziiert, die eine solche Regulation auf posttranskriptioneller Ebene koordinieren.Unser Ziel ist eine umfassende Charakterisierung RNA-bindender Proteine, die an der Regulation von circadianen Oszillationen auf RNA-Ebene beteiligt sind. Als Beispiel für eine circadian oszillierende RNA dient das Transkript, das für das RNA-Bindeprotein AtGRP7 (Arabidopsis thaliana glycine-rich protein 7) codiert. Diese RNA ist eine der am stärksten exprimierten RNAs in Arabidopsis und oszilliert mit sehr hoher Amplitude und einem Maximum am Abend. Durch mathematische Modellierung wurde gezeigt, dass eine Regulation auf posttranskriptioneller Ebene zusätzlich zur transkriptionellen Regulation des Promotors für die Oszillation des Transkripts notwendig ist.Zur Identifizierung von RNA-Bindeproteinen, die in vivo an das AtGRP7 Transkript binden, werden wir RNA-Protein-Komplexe in vivo mittels UV Licht quervernetzen und das Transkript mittels langer biotinylierter antisense-Oligonukleotide präzipitieren. Diese Oligonukleotide sind entweder gegen das endogene AtGRRP7 Transkript gerichtet oder gegen verschiedene RNA tags, mit denen das AtGRP7 in transgenen Pflanzen markiert wurde. Anschließend werden die Komplexe mittels magnetischer Streptavidin beads präzipitiert und die Proteine eluiert. Die Methoden werden anhand der Anreicherung des AtGRP7 Transkripts und der Abreicherung von ribosomaler RNA sowie anhand der Anreicherung bereits bekannter AtGRP7 Interaktionspartner und der Abreicherung von irrelevanten Proteinen optimiert. Die erfolgreichste Methode wird für die globale Charakterisierung von RNA-Bindeproteinen mittels LC-MS/MS eingesetzt.Die Funktion ausgewählter RNA-Bindeproteine für die korrekte AtGRP7-Oszillation wird mit Hilfe von Mutanten untersucht. Ferner werden wir mittels iCLIP die exakten Bindungsstellen der Proteine auf dem AtGRP7 Transkript sowie das ganze Spektrum ihrer target Transkripte identifizieren. Insgesamt trägt das Projekt dazu bei, zu verstehen, wie RNA-Bindeproteine circadiane Transkript-Oszillationen regulieren. Dies wird wesentliche Einsichten in die generelle Organisation posttranskriptioneller Netzwerke in der Zelle liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen